Способ количественного определения солей нуклеозидфосфорных кислот

 

Союз Советских

Социалистических

Республнк

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТВЛЬСТВУ (и) 577459 (61) Дополнительное к авт. свнд-ву (22) ЗаЯвлеио04.01.76 (21) 2338060/04 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет

2 (51) М. Кл.

6 01 Н 31/16

Государстовнный комитет

Совета Минюстроа СССР оо долам нзоорвтвннй н открытии (43) Опубликовано25.10.77.бюллетень №39 (И) УДК 543.24 (088.8 } (45) Дата опубликования описания 22.11.77 (Т2) Авторы изобретения

A. Я. Вевернс и У. Я. Микстайс (Т1) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЮ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОЛЕЙ

НУКЛЕОЗИДФОСФОРНЫХ КИСЛОТ сида.

Изобретение относится к количественному определению солей нуклеозидфосфорньц, кислот (нуклеозидов), H уклеозидфосфорные кислоты являются полифункцибнальными природными coeäèíåниями, которые входят в состав нуклеиновых кислот и коферментов. Соли нуклеозидфосфорных кислот применяются в медицине, биохимических и биологических исследованияхх.

Известен способ определения солей нуклеозидфосфорных кислот методом хроматографии на бумаге, пропитанной ацетатным буфером 11, !

Недостатком способа является его невысокая точность и длительность (3-16 час), Известен способ количественного определения солей нуклеозидфосфорных кислот путем обработки пробы вешества избытком р хлорной кислоты с последуюшпм титрованием получен..ой смеси основным титрантом в среде метилзтилкетона 2), Недостатком известного способа является ограниченность применения, так как спо2 соб не применим для анализа солей, нерастворимых в метилэтнлкетоне, 11елью изобретения является расширение области примененИя способа.

Для этого пробу анализируемого вешества обрабатывают избытком хлорной кислоты с последуюшим титрованием полученной смеси основным титрантом в среде смеси метилцеллозольва и диметилсульфоксида, взятых в соотношении 1:2-10, Отличительной особенностью предлагаемого способа является использование органического растворителя - смеси метнлцеллозольв — диметилсульфоксид в соотношениях

1:2-10 по объему.

Положительный эффект достигается сочетанием растворяюших и дифференцнруюшнх свойств метилцеллозольва н диметилсульфокВ метилцеллозольве растворяются соли яуклеозндфосфорных кислот н сильные основания, в диметилсулъфоксиде — нуклеотиды, иуклеозиды и продукты титровання. В смеси метилцеллозольв-диметилсульфоксид рас

577459 ворение достигается без нагревания и расш епле ни я нукле оти дов, Растворение и дифференцирование обеспечиваются только в следующих соотношенияхметилцеллозольв/ диметилсульфокси д, равное

1:2-10 по объему. Г!ри более низких соотнон«ениях не достигается полное растворение определяемого образца и продуктов титрования. Разложение полностью при более высоких соотношениях не проводится и не обеспечивается дифференцирование.

Способ заключается в следующем, Íàвеску определяемого образца (0,01-0,03г) в ячейке титрования обрабатывают с 1-2мл хлорной кислоты в метилцеллозольве и 2мл диметилсульфоксида. Раствор перемешивают до полного растворения навески, Затем в раствор добавляют еше 2-8 мл диметилсульфоксида, погружают в раствор пару элек тродов (например, стеклянный -каломельнь«й) и проводят потенциометрическое титровакие стандартным раствором сильного основания, например гидроокисью калия, гидроокисью тетраэтйпаммония в спирте. На кривых пэтенциометрического титрования появляются

3-4 скачка потенциала, Первый скачок всег да соответствует с гтитрован««.э остатка хлорной кислоты, а последующие — дифференцированному титрованию кислотных групп нуклеозидфосфорных кислот. Ошибка + 2-3,.

Пример 1. Определение смеси диI калиевой соли аденозин-5 -"монофосфорнои

t кислоты с аденозин-5 -монофосфорной кислотой.

Навеску образца величиной 0,02075 г обрабатывают точно 1,00 мл 0,1233 к,хлор ной кислоты в метилцеллозольве, добавляют

2 мл диметилсульфоксида ("x ч") и раствор перемешивают в течение 5-7 мин до полного растворейия навески. Затем добавляют еше 5 мл диметилсульфоксида и раствор потенциометрически титруют 0,1507 н,раствором гидроокиси калия в этаноле, На кривой титрования появляются 3 скачки потенциала. Первый соответствует оттитрованию непрореагировавшего остатка хлорной кислоты. По сривой находят, что при этом израсходовано 0,45 мл титранта. По формуле — — . ()

1 ° 0 1233 что 0,37 мл титранта соответствуют определению динатриевой соли нуклеотида (мол.в, 423), т.е, содержание нуклеотида в смеси 5 . Последующие два скачка соответствуют последовательному оттитрованию двух фосфорнокислых групп, причем на титрованне обеих израсходуются одинаковые объемы титранта — по 0,39 мл. Ис:.ользуя объем, прошедший на титрование лия, определяют, что на титрование каждой фосфоркэки "лой группы израсходуются

0,17 мл титраита. Ilo известной формуле (мол.в. 347), найдено, что содержание аденозин-5 — монофосфоркой кислоты в сме.

l си с оставляет 4 2, 7%.

Пример 2. Определение смеси диР натриевой соли цигидин-2, 3 -монофосфорной кислоты с гидроокисью натрия.

Навеску образца величиной 0,02241 г

10 обрабатывают 2,00 мл 0,0995 н,хлорной кислоты в метилцеллозольве, добавляют

2 мл диметилсульфоксида и перемешиваю« раствор в течение 5-7 мик до полного растворения. Затем в раствор погружают пару электродов„,добавил«««эг ешс 4 мл ииметилсульфоксида и титр «ст О, 1.825««...рост вэрк". гидроокиси тетраэтила«мония в изэ— пропаколе. На кривой титровакия ««Dякляктся 3 скачка потенциала 11D BTDDD«43 и третьему cka÷êà«!. кс эрь«е соэтветствукт эт-. ти « ээваки«О фэсфээкэкислых гp ïè, эпре,"«D— ..«Иют Од:и«акэвый расхэд «итракта --О, 2 «

Исхэ««я из этого объема «о известкой формуле, в««чисг«я«эт сэдержакиэ эирс-. дел яемэй сэ;и: куклеэтида — 83,7",, 1!скол«уи эб-:,ем титракга, Исшедший ка титрэвание Dcтатка хлээкэй. кислоты (0,07:. D«) и Об.,э,и.«, изI расхэдэваккь е ка -итрэв«и иэ эбг.. : ц«эсфэр-яокксль х гру пт по формуле Х

30 0,08 -0,28 2, Опэедэля«ст, чтэ . а эиредеJIc««««e гидэээкиси натрии расхэдукэтс««

0,45 к«л титржгга., Пэ известкой фэрмуле

«зь«ч««сля«эт сэдержакие гидроэкиси катэия в смэс и — 1 4,6,.

Пример 3. Определекие с".. еси моно-! катриевой соли уэиаик — 2, 3 — «к«клэфэсфОГ «D«« кислоты ««д«и :атр I! BОЙ соли уэидие« вЂ” э — « ". Dиофэсфоркэй кислоты.

40 Навеску образца 0,02563 г Обрабатыва«эт

1„00мл 0,21 —" к. и раствоэа хлоркой кислоты в метш«целлюлозсс«ьве и 2 мл д««мет«глсул« фоксида (хч). Переме«иивакт (5-10 м««н) до полного растворения образца, затек дэбав45 ляют еще 8 мл диметилсульфэксида, погружа«эт электроды и Осуществг«««ют поте««ц «эк«етрическое титровакие 0,1825 H раствором гидроэкиси тетоаметиламмокия B изш«ропакэле, На кривой титрэвакия появляются 3 ска «50 ка потенциала: первый соотве гствует DTT!! Tровакию остатка хлоркой кислоты и сээтве — ствует 0,53 мл, второй соответствует титрованию сильных фосфорных групп Обэ«ж куклеотидов и составляет 0,40 мл, третий

55 совместному титровакию эдкэй фэсфээкэкис-лой группы мокэфэсфоркой кислоты и кислотных групп пиримидинового гетероцикла оэоих куклеэтидов и составляет 0,64 мл, 11э раз = ности объемов THTpG««Tà, ««зрасхэдэва«««««, x

60 на .второй и третий скачки иэгекцилла, .ка"577459

0,23 мл находят, что на титрование другой соли нуклеотида расходуется 0,17 мл титранта, Вычисляют содержание натриевой соли уридин-2,3 -циклофосфорной кислоты в

I смеси — 3 9,6%.

Результаты определения смесей превгтавлены в таблице.

14,35

10,28

14,15

10,35

1:5

+0,7

А-3 -МФ дикалиевая

Ф с on ь+А -2, 3 — ЦФ кал нева я

12,76

13,80

-1,7

-1Р7

12,55

13,57

1:3 соль!

B-3, 5-ЦФ калиевая соль !

+ У-2, 3-ЦФ калиевая соль

11,92

14,66

+1,3

11,77

14,32

У-5 -МФ пикалиевая соль +

+ KOH

-1,4

-1,8

25,10

25,46

1 2

7,00

7,13

Г-5 =МФ пинатриевая соль +

+0,9

11,28

i8 95

11,18

l8,60

+1,9

+гуанозин

1:10

-1,6

-3.0

26,31

26,73

5,44

5,28

1:7

22,26

10,63

А-5 -ТФ тетранатриевая

1 сол ь+а денозин

1:8

I I I

Примечание: А-5 -МФ -апенозин-5 -монофосфорная кислота> A-2,3 — БФI — апенозин-2,3-циклофосфорная кислота, У-5 -МФ-уродинмонофосфорная кислота, 1 I у I )

У-2,3 -ЦФ-урипин-2, 3-пиклофосфорная кислота, Т-2 (3)-МФ тимидин-2 (3)л — монофосфорная кислота, Г-5 -МФ-гуанозин-5-монофосфорная кислота, J

А-5 — ТФ-апенозин-5 -трифосфорная ки ..лота.

Формула изобретения ботки пробы анализируемого вешества избытком хлорной кислоты с последукхцим титрованием полученной смеси основным титрантом в среде органического растворителя. дено, что на титрование динатриевой соли уридин-5 -монофосфорной кислоты израсхо-! повано 0,23 мл титранта, содержание этой соли вычисляют по известной формуле и составляет 60,2 О, llo разности обьемов 0,40!

А5 -МФ динатриевая соль+А-5МФ

Т-2 (3 ) -МФ дикалиевая соль + КОН

Способ количественного определения солей нуклеозидфосфорных кислот путем обра22,02

10,95

-1,1

+3 0

577459

Сос гавитель С, Хованская

Редактор Н, Лжарагетти Техред Н. Андрейчух Корректор М. немчик

Заказ 3675/33 Тираж 1101 Подписное

14НИИГ1И Государатвенного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113036, Москва, Ж-35, Раушская наб„д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

7 отличающийся тем, что,спельк расширения области применения способа, в качестве органического растворителя используют смесь метилцеллозольва и диметилсуль фоксида,, взятых в соотношении 1:2-10, Источники информации, принятые во внимание при вкспертизе;

1. Губен-Иейль, Методы органическ". химии. М., "Химия", 1967, с, 910-911

2. Крешков А, ф, Быкова Л, Н. и

Каэярян Н, К. Кислотно-основное титрование в неводных растворах. М., "Химия, 1967, с. 141-159,