Способ получения -аминокислот

 

ОПИСАНИЕ

Союз Советских

Социалистических

Республик

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) дополнительное к авт. свид- ву— (22) Заявлено 40176 (21) 2307306/23-04 с присоединением заявки ряе (23) Приоритет (43) Опубликовано 0502..78.Бюллетень М 5

Гяетдаретвеяяый яввятет

Савета Мяяявтрвв CCCF яв девая яавбретеябд я втярытяя (53» УДК 547. 466.07 (088. 8) (45) Лата опубликования описания 26.01.78

И.Р.Страэдинь„ И.П.Розиня, В.Э.Калнс и А.К.Арен (72) Авторы изобретения

P1). Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ). -АМИНОКИСЛОТ билнэованную на силохроме или силикагеле (3) .

По э ому способу L-аминокислоты получают многократно (5 раэ) из 0,5 М

5 растворов исходных N-ацнл- П(- -аминокислот в присутствии .аминоацилазы, адсорбированной на силохроме.

Однако и этот способ имеет ряд существенных-недостатков, основными из

10 которых являются сложность процесса ввиду того, что требуется .сильное сгущение реакционной смеси при выделении целевого продукта, так как концентрация исходной N-ацил-1)L -аминокислоты:

N ограничена (0,5 М) применением адсорбированной аминоацилазы,. которая может вымываться из носителя при повышенных концентрациях субстрата; относительно, низкий выход целевого.продук® та, так как иэ-эа низкой стабильности адсорбированной аминоацилазы возможио осуществление лищь 5-кратного полу.чения (-аминокислоты с одной и той

25 же порции нерастворимого фермента.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта и упрощение про,цесса. Поставленная цель достигается, тем, что в качестве катализатора используют аминоацилазу,ковалентно свя-, l

Иэобретение относится к усовершенствованному способу получения с.—

-аминокислот, широко применяемых в микробиологической., медицинской и пищевот промышленности.

В химической. промышленности аминокислоты получают в процессе асимметрического гидролиза рацемических .М -ацил-13L -аминокислот с помощью иммобилиэованной на носителе амнноацилаэы.

Известны в частности способы гидролиза с помощью аминоацилаэы,иммобилиэованной на органических носителях, например на бромацетилцеллюлозе (1), на ДЭАЭ вЂ” сефадексе t2j, Но использование большинства подобных материалов ограничено их неудовлетворительной 4ильтрующей .спо- . собностью, подверженностью действию. микроорганизмов, механической нестабильностью. . Известны также способы получения

-аминокислот иэ N-ацил-91-аминокислот с помощью аминоацилазы,иммобилиэоваиной на неорганическом йосите- " лв.

В частности известен способ, в ко» тором используют аминоацилазу, изеао(5l) N. Кл.

С 07 С 101/02 занную с сяланязированным носителем через симм-тряазяновый цикл.

Предлагаемый способ получения

-аминокислот заключается в следующем: катализатор с ацилазной активностью, приготовленный сяланизярованием сялохрома яля силикагеля- g -амянопропилтриэтоксясиланом и присоединением аминоацялазы через производное .дихлор-симм-триаэяна, например активно- 10 го красителя ярко-голубого КХ или ярко-оранжевого, хранящегося при 4-9 С в растворе N -ацетиламииокислоты, отфильтровывают, промывают 0,1 М Фосфатным буфером с рН 7,2 и еще влажный помещают в сосуд для проведения . реакции.

Иэ предназначенного для превращения количества рацемической )4 -ацилажянокислоты готовят водный растворр 20 рН которого устанавливают концентрированным водным аммиаком на 7-8,что-бы концентрация исходной N-ацилаамино кислоты была от 0,5,до 1,0 М„я вводят в сосуд с катализатором.

Реакционную смесь выдерживают при

37-40 C изредка перемешивая до завершения реакции получения L -аминокислоты, прячем молярная концентрация образующейся (-аминокислоты достигает половины концентрация исходной рацемической )4-ациламинокислоты.

Отфильтровывают катализатор от реакционной смеси, промывают 0,1 N фосфатньы буфером с рН 7, 2, после чего его можно испольэовать повторно; такое использование беэ снижения ферментатявной активности катализатора можно повторять не менее 10 раэ. Раствор получаемой реакционной смеси концентрируют в вакууме пря 0-50 С, образую- 40

-аминокислоту выделяют известными приемами.

Повышенная устойчивость ковалентно связанного Фермента по сравнению с адсорбированным позволяет работать с более концентрированными растворами субстратов и увеличить кратность использования ковалентно яммобилизованной аминоацялазы„ тем сам=1 повысив выход целевого продукта примерно вдвое0

Пример 1. 20 r силохрома С-80 (Фракция 0,1-0,16 мм), б мл 1 -амико-:".ропилтряэтоксисилана и 200 мл абсолютного этанола кипятят при перемешивании 30 ч. Силаниэированный силохром отфильтровывают, промывают 1 л абсолютного этанола. Продукт сушат сначала на воэдухе в теченяе 12 ч, потом

1 ч над пятиокисью фосфора в вакууме (5 мм рт.ст.) при 180-190 С.

Количество аминогрупп 600 мкмоль/г 60 носителя

4 г силанизированного силохрома смешивают с раствором 0,15 г активного красите ярко-голубого КХ в 60 мл диметялформамида и оставляют на 12 ч 65 пря коМнатной температуре. Продукт отфильтровывают, промывают 30 мл диметнлФормамяда и сушат в вакуум-эксикаторе. ь

K 1 г активированного носителя прибавляют 1 мл экстракта ацетонового порошка свиных почек в 0,1 н. Фосфат.ном буФере (рН 7,2) с общей ацилазной активностью 2000 мкмоль/час L -аланина и 4 мл 1 М Я -ацетил-QL -аланина, выдерживают 10 мин при комнатной: температуре. Иммобилизованную аминоацилазу отфильтровывают, промывают дважды 20 мл 1 М раствора хлористого натрия, 20 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2) .

Получают катализатор с общей ацилаэой активностью lp00 мкмоль/час аланина.

Полученную иммобилиэованную аминоацилазу хранят в растворе N -ацетилаланина при 4-9 С.

Пример 2. 2 г катализатора с ацялаэной активностью 1000 мкмоль/час

L -аланина, полученного согласно ме-. тодике примера 1, загружают в колбу с 100 мл 1 М раствора рацемического

14 -ацетилаланяна рН которого устанавливают. концентрированным аммиаком на 8,0.и выдерживают в термостате при

37-40 С в течение 24 ч. После окончания реакции катализатор отфильтровывают, промывают 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,2 и используют вторично.

Полученный раствор. обрабатывают активированным углем, упаривают в вакууме до сиропа при 45 С. После охлаждения до комнатной температуры добавляют. 100 мл зтанола и останавливают на 16 ч при 4 С для кристаллизации.

Кристаллы L -аланина отфильтровывают, промывают спиртом я высушивают при

50 С до постоянного веса.

Выход L-аланина 3,9 r (87,5Ъ). (А) з =+14,2 (c=l; 5н. соляная кислота) .

Вычислено,%: С 40,44; Н 7,92;

Я 15,72.

Йайдено,В: С 40,49; Н 8,04; Я 15,74, Пример 3. Гядроляз К-ацетилаланина осуществляют, как s примере 1, с многократным введением в процессе катализатора, использованного в примере 2 (2 r катализатора с ацилазной активностью 1000 мкмоль/час L -аланина)..

Катализатор в процессе гядролиза используют 9 раз без снижения ацилазной активности.

Общий выход L --аланина 39. г на

10 процессов.

Выход L-аланина на 1 r катализато-; ра 19,5 r.

Прймер 4. 2 r катализатора с ацялаэной активностью 1200 мкмоль/час

1. -метионина загружают в колбу с

100 мл 1 М раствора рацемического Кацетилметионина, рН которого устанав-1

Формула изобретения

Составитель С.Плужнов Гехред М.Келемеш Корректор,:И.Демчик

РЕдактор T.IIIàðãàíîâà

Заказ 527/20 Тираж 559 Подписное

ЦИНИПИ ГосударствЕнного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений в открытий

113035, Иосква, Ж-35, .Раушская наб.у д. 4/5

Филиал IIIIII патент, г.ужгород, ул. Проектная, 4 ливают концентрированным аммиаком на

В,О, и выдерживают в термостате при

37-40 С в течение 21 ч. После окончания реакции катализатор отфильтровывают, промывают 0,1 И фосфатным бу- 8 фером с рН 7,2,используют вторично.

Полученный раствор обрабатывают. активированным углем, упаривают в вакуу-. ме до сиропа при 45 C.Ïocëe охлаждения до комнатной температуры добавля- )0 ют 100 мл этанола и оставляют на 16 ч при 4 С для кристаллизации. Кристаллы

1- -метионина отфильтровывают, промывают спиртом и сушат при 50 С до постоянного веса.

18

Выход Ь -метионина.б,54 г (883). ) =+25 (c=0,5-2,0; 5н, соляная кислота) .

Вычислено,4:C 40,25; Н 7,43;. Я 9, 39.

Найдено, в Ъ: С 40,16; Н 7,51;

Я 9,62.

Пример 5. Гидролиэ N -ацетилметионина осуществляют по методике приме, ра 4 с многократным введжгем в процесс катализатора, использованного в примере 4 (2 г катализатора с ацилаэной активностью 1200 мкмоль/час

-метионина).

Катализатор в процессе гидролиэа используют девятикратно беэ снижения ацилаэной активности. . 30

Общий выход L -метионина 65,4 г за

10 процессов.. Выход (. -метионина на .1 г катализатора 32,7 г.

Пример 6. 2 r катализатора с аци азной активностью 940 мкмоль/час . -серина загружают в колбу с 100 мл

1N.раствора рацеьщческого L -ацетилсерина, рН которого устанавливают концентрированным аммиаком на 8,0, и вы- 40 держивают в термостате при 30-40 С в течение 27 ч. После окончания реакции катализатор отфильтровывают, промывают 0,1, И фосфатным буфером с рЯ 7,2 и используют вторично, Полученный раствбр обрабатывают активированным углем, упаривают в вакууме до сиропа upi; 45 C. После охлаждения до комнатной температуры добавляют 100 мл этанола и оставляют на 16 ч при 4 С для кристаллизации. Кристаллы (--серина отфильтровывают, промывают спиртом и высушивают при 50 С до постоянного веса.

Выход L -серина 4,6 r (90%).(4.)1)=

=+13,5 (c 0,5-2; 5н. соляная кислота).

Вычислено,Ъ: С 34,29;Н 6,71; И I.3,38

Найдено,%: С 34,40;Н 6,51," N 13,71.

Пример 7. Гидролиэ М-ацетилсерина осуществляют по методике примера б с многократным введением в процесс катализатора, использованного s примере 6 (2 r катализатора с ацилазной активностью 940 мкмоль/час )-серина).

Катализатор в процессе гидролиэа используют девятикратно без снижения ацилаэной активности °

Общий выход 1.-серина 46 г за 10 процессов. Выход 4-серина на 1 г катализатора 23 г.

Способ получения Ь -аминокислот путем асимметрическОго гидролиэа рацемических К -ациламинокислот в присутствии катализатора-иммобилизовай-. ной аминоацилазы,о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения процесса, в качестве катализатора используют аминоацилазу, ковалентно связанную с силанизкрованным носителем через симм-триазиновый цикл..

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1 .. Патент ФРГ 9 2105009,кл.12фб/01>

15.11.73.

2. Патент Англии 9 1072876„ кл. С 2С, 21 06.76.

3. Авторское свидетельство СССР

В 523892, кл.С 07 С 101/02, 1976.