Реактив для определения крови и гемоглобина в биологических жидкостях

 

Союз Советских

Социалистимеских

Республик

ОП ИСА

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (11) 607140 r„gl N 33ЛЬ." «",У

-. j (61) Дополнительное к авт. свил-ву (22) Заявлено 28.10.75 (21) 2183752/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано15.05.78.Бюллетень № 18 Государственный комитет

Совета Миниотраа СССР оо делам изооретеннй и открытий (53) УДК 612.11/12 (088.8) (45) Дата опубликования описания26.04.78

Иностранцы

Властимил Свобода и Олга Челеховска (ЧССР) (721 Авторы изобретения

Иностранное предприятие

"Лахема, н.п. (ЧССР) (71) Заявитель (54) РЕАКТИВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КРОВИ И ГЕМОГЛОБИНА

В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ

Органический амин

Кислотный буфер

0,2-40

Остал ьн ое.

Пленкообразующее вещество

Соль гидроперекиси

Хром оген

Детергент

Активатор пероксидазн ого действия гемоглобина

2,5-25

2 -20

015-5

0,004-4

0,1-10

Изобретение относится к области медицины,а именно к биохимическим диагностическим исследованиям.

Известен реактив для определения крови и гемоглобина в биологических жидкостях, содержащий кислотный буфер, хромоген, детерТент, активатор пероксидазного действия гемоглобина и органическую гидроперекись 1 1).

Однако известный реактив недостаточно чувствитечен и стабилен при хранении.

Для повышения чувствительности и стабильности при хранении предлагаемый реактив содержит пленкообразующее вещество, а органическая гидроперекись содержится в форме соли с органическими аминами с константой диссоциацни не ниже 8 при следующем соотношении компонентов, вес,% т

Реактив для определения крови и гемог„лобина в биологических жидкостях содержит

1. органические гидроперекиси с различными элифатическими, алициклическнми и гетероциклическими аминами или аминоспиртами, например с пиперазином, 1,4 диазабицикло-(2,2,2)-октаном, мочевиной, гексаметилентетрамином, 2-амино-2-метил-l, 3-пропендиолом, З,З-диамино-2-пропанолом, 3,3-диаминодипропилалеином, моно- и диэтаноламином или циклогексиламином при условии, что константа диссоциации этих аминов не ниже 8 и они образуют с органическими гидроперекисями твердые стабильные нелетучне комплексы. Для пропитывания берут раствор органической гидроперекиси и избыток одного из перечисленных аминов в пригодном неводном растворителе типа бензола, толуола, эфира, хлороформа, этилендихлорида, бензина, этплацетата в смеси с метанолом, этанолэм или пропиловым спиртом. Этот раствор перед нанесением на бумагу выдерживают в

607140 темном месте в хорошо закрытом сосуде не менее. 48 ч.

Органический алифатический, алициклический или гетероцикпический амин, константа которого выше 8, взятый в избытке, стабилизирует соль органической гидроперекиси с органическим амином и тем самым также предохраняет от разложения.

Пригодным амином может быть не только алифатический, алициклический или гете- 16 роциклический амин, можно применять соль органической гидроперекиси с 1,4-диазабицикло-(2,2,2)-октаном и для получения избытка амина используют другой амин, напри мер 2-метил-2-амино-1,3-пропандиол или мочевину, или смесь двух или нескольких этих аминов, Реактив содержит также полимерное природное или синтетическое органическое пленкообразуюшее вещество, которое защищает

acro индикационную зону от воздействия ат» мосферы, например от воздействия воздуха и влаги.;

В качестве твердого полимерного природ25 ного или синтетического пленкообразуюшего вещества используют, например, альгинат натрия, полнвинилпиролидон, поливиниловый спирт, крахмал, попивиннлпропионат, поливи нилбутират карбоксиметилцеллюлозу, поли-!

30 этиленгликоль с молекулярным весом 2000

15000, Можно применять и смесь двух или нескольких этих веществ..

Так, в качестве кислотного буфера приме. няют смесь многоосновной органической или

5 минеральной кислоты с константой диссоциации рК 1;0-5,0 и ее натриевой, калиевой или аммониевой соли, или же смесь первйчных или вторичных солей таких кислот, например буфер на основе смеси лимонной кислоты, нитрата натрия, винной кислоты; тартрата натрич, яблочной кислоты, буры, монофталата калия, нормального фтапата калия или моносукцината натрия, нормального сукцината натрия. Вид и концентрация этого бу-4 фера не играют решающий роли, но величина рН, устанавливаемая с помощью буфера, долж на быть 2,5-5,0.

В качестве хромогена используют органические вещества, которые устойчивы и способ н ны окисляться применяемой гидроперекисью. в присутствии гемоглобина, предпочитается бесцветность хромогена, этому условию удовлетворяют например о-толидин, 2,7-диаминс— флуорен, о-дианиэидин, бензидин или заме щенные азины и их соли.

В качестве активатора пероксидазного действия гемоглобина используют хинолнн и .его производные, например хинин, цинхонин, б-метоксихинолин, хинальдин, 8-амино-6- 6р

-метоксихинолин; 2-хинолин и другие. Добавка этих активаторов ускоряет ход реакции окисления и повышает интенсивность окраски окисленной формы хромогена, что способствует повышению чувствительности реактива.

Основным условием высокой стабильност реактива является отделение кислотного бу« фера и хромогена от соли органической гидроперекиси и органического амина. Это достигается тем, что на пригодную пропитыва« юшую подложку, лучше на фильтровальную бумагу, наносят сначала водный или водноспиртовой раствор буфера и хромоген, а за тем после тщательного высушивания на первую пропитку наносят раствор органической соли гидроперекиси с избытком амина, причем этот второй раствор приготавливают а неводных растворителях, таких как бензол, толуол, хлороформ, этилендихлорид, эфир,ацилацетат и другие в смеси с метанолом, этанолом или пропанолом. Все другие компоненты могут быть добавлены к обоим пропиточным растворам.

Иногда целесообразно, чтобы в первом пропиточном рас воре. испольэовали одно соединение, à Ро втором — другое, например, в первом пропиточном растворе — в качестве смачивателя — анионактивный лаурилсульфат или диалкилсульфосукцинат,. а в качестве пленкоо6разующего полимерного соединения, например поливиниловый спирт, а во втором пропиточном растворе - в качестве неионогенного смачивателя - полиоксиэтнлнрованный лауриловый спирт или.этоксилированный олеиловый спирт, в качестве пленкообразуюшей добавки — поливинилпиролидон. Можно получить бума у с трехкратным пропитыванием; а именно, первый пропиточный состав содержит кислотный буфер, хромоген, активатор пероксидазного действия гемоглобина, анионактивный смачиватель и поливинилпиро лидок, второй — только поливиниловый спирт или альгинат натрия или же смачиватель, а третий пропиточный состав — соль органической гидроперекиси, органический амин, неионогенный смачиватель, а также полнвнниловый спирт.

При получении реактива, бумагу следует после каждого пропитывания тщательно высу« шивать перед нанесенйем следующего пропиточного состава, Реактив готовят таким образом, что все необходимые компоненты растворяют в импрегнирующем растворе, который наносят на влагоемкую подкладку и высушиванием устраняют растворитель, использованный для

:подготовки раствора.

Далее приведены примеры импрегнирующих растворов, где содержание компонентов в гоаммах приведено на 100 мл раствора.

607 140

Пример 1. Раствор 1.

Хромоген (0,8-1,5 r о-толидиндихл оргидрата) 0,25-2,50

Пленкообразуюшее вещество (0,8-1,5 г поливинилпиропидона) 0,25-2,50.

Активатор пероксидазного действия гемоглобина (0,0080,8 г лепидингидрохлорида)

Смачивающее вещество (0,05-0,25 г аниоактивного смачиваюшего вещества) 0,002-2,0

Кислотный буфер рН 2,55,0 (20-30 мл 2 н.цитратного буфера рН 3,04,0)

Этанол

Вода

0,05-5,0

15

10-50мл

0- 50мл

50 — 90 мл

Раствор 2, Соль органической гидроперекиси (3-6 г соли фенилизопропилгидроперекиси с 1,4-диазобицикло-(2, 2,2)-октана) 1-10

Органический амин (3-6 r

1,4 диазобицикпо-(2,2,2).октана 0,05-20

Смачиваюшее вещество 0,-1,0

Пленкообразуюшее вещество

30 (5-8 г поливинилпиролидона) 1-10

Безводный растворитель (толуоп или бензол)

Низший алифатический спирт (безводный этанол) 0-60 мл

Благодаря такому приготовлению, отдельные пропиточные составы полностью отделены друг от друга, так как бумагу высушивают после каждого нанесения.

После погружения в водную жидкость, например мочу, начинают взаимодействовать все компоненты, причем из солей органических гидроперекисей под влиянием кислотного буфера выделяется свободная гидроперекись, которая затем в присутствии гемоглобина 4, окисляет хромоген с образованием окрашенного продукта окисления, 25

40-100 мл

Реактив для определения в крови гемоглобина имеет кремовато-желтую окраску.

После погружения реактива в воду или в другую жидкость, например мочу, которая не еодержит ни гемоглобина, ни крови, реактив сохраняет свою первоначальную окраску, в присут твии же дажеследовкрови или гемог55 лобина он окрашивается в синий цвет, причем, интенсивность этого окрашивания прямо пропорциональна количеству крови или гемоглобина, присутствующего в исследуемой жидкости, Сравнивая с эталонной шкалой окрас- 0 ки, изготовленной специально, можно с большой. точностью определить количество крови или гемоглобина по реактиву.

Реактив для определения крови и гемоглобина в биологических жидкостях обладает большой чувствительностью и приобретает светло-голубое окрашивание уже в присутствии 1-2 эритроцитов в 1 мл воды или 5-10 эритроцитов в 1 мл мочи.

Реактив довольно чувствителен к влаге воздуха, поэтому хранят его в герметичной упаковке над осушителем (например силика1епем, молекулярными ситами). В таких условиях реактив может храниться в течение многих месяцев, не теряя чувствительности и не разлагаясь.

Пример 1. Пропиточный раствор 1.

5,0 r о-толудиндигидрохлорида растворяют в смеси 100 мл 5%-ного водного раствора поливинилпиролидона, затем прибавляют

150 мл 2 н. цитратного буфера с рН 7,0;

50 мл 100%-ного водного раствора солянокислого лепидина и 10 мл 5%-ного водного раствора лаурилсульфата натрия.

Пропиточный раствор П., 40 г соли фенилизопропилгидроперекиси с

1,4-диазабицикло-(2,2,2)-октаном, 50 r

1,4-диазабицикло-(2,2,2)-октана и 20 г поливинилпиролидона в указанной последовательности растворяют в 1000 мл 4%-ного раствора поливинилпиролидона в смеси этилбвого спирта и толуола 1:2.

Приготавливают реактив следуюшим образом. На полоску фильтровальной бумаги плотностью 150 г/м и шириной 80 мм на рас2. стоянии 6 мм от кромки наносят 5%-ный раствор этилцеллюлозы в спирте, высушивают, благодарй чему осуществляется гидрофобное пропитывание; между слоем этой пропитки и кромкой бумаги наносят 2 мл пропиточного раствора T. на 1 м бумаги и бумагу хорошо высушивают током горячего воздуха, нагретого до 80-85 С, На эту первую проо питку на 1 м бумаги наносят 1,6 мл пропи.точного раствора П и бумагу высушивают..

Полоски бумаги затем разрезают поперек на полоски шириною 6 мм, благодаря чему . получают реактив 6х80 мм, кремовато-желтого цвета, который она сохраняет после погружения, например в мочу, в которой нет ни крови, ни гемоглобина.

В присутствии же следов крови или гемоглобина в исспедуемой жидкости реактив приобретает интенсивную синюю окраску, причем выраженное синее окрашивание возникает уже при содержании крови в воде при разведении 1;5000000 и в моче при разведении

i:1000000, что соответствует наличию 4-6 эритроцитов в 1 мл. С увеличением концентрации крови или гемогпобина в исследуемой

607140 жидкости возрастает и интенсивность синей окраски реактива.

Сравнением окраски с этанонами определяют содержание крови или гемоглобина в исследуемой жидкости B зависимости эт интенсивности окраски реактива, Л р и м е р 2, Пропиточный раствор1, 5 г соляцокислого о-толидина растворяют в

125 мл волы, затем прибавляют последовательно 125 мл 5%-ного водного раствора поливинилпиролидона, 10 мл цитратного буфера с рН 3,0, 50 мл 10%-ного водного раствора солянокислого 2,4-диметилхинолина, 30 m

5%-ного раствора оксиэтилированного лаурилового спирта в этаноле. 15

Пропиточный раствор П, 20 r соли фенилизопропилперекиси с 1,4-диазобицикло-(2,2,2)-октаном и 25 r пиперазина растворяют в 500 мл 4%-ного раствора поливинилпиролядона в смеси этанол-бен- 20 зол (1:1).

Реактив, пропитанный этими растворами, получают, как в примере 1. Реактив обладает теми же свойствами, как в примере 1.

Пример 3.Пропиточный раствор Z.

5,0 r гидрохлорида 2,7-диаминфлуорана раст.воряют в 250 мл 2%-ного водного раствора полиаинилпиролидона, затем к этому раствору прибавляют последовательно 150 мл 2 тартрантного буфера с рН 0,4, 50 мл 10%-но30 го водного раствора гидрохлорида хинолина в 1 мл сополимера изооктилфеноксиполиэтанола с окисью эталена.

Прэпиточный раствор П.

25,6 г 1-гидрооксициклогексип-1-гидропере35 киси и 60,7 г 1,4-диазобицикло-(2,2,2)-октана растворяют в 1000 мл 4%-ного раст, вора, попивиниппиропндона в смеси этанола с хлороформом (1:2), Приготовленный раствор

40 выдерживают в течение 48 ч в темном месте в хорошо закрытом сосуде.

Бумагу, пропитанную этими растворами, приготавливают по способу, описанному в примере l. Чувствительность индикаторной бумаги около 1:2500000 в воде и

1:500000 в моче.

Пример 4. Пропиточный раствор T., 200 мл 2 и. цитратного буфера с рН 3, 37, 200 мл 2,5%-н ого водного раствора поливинилпифолидэна и 60 мл насышенного раствора о-толидингидрохлорида растворяют в смеси этиловый спирт: вода-2:3 и затем к раствору последовательно прибавляют 20 мл 10%ного водного раствора соляпокислого лепиди55 на и 40 мл 50 -ного спиртового раствора диэктилсульфоянтарнокислэгэ натрия, Пропиточный раствор I I, 10 r фенилпзопрэпилгидр перекиси и, аствор

40 г 2-аминэ-2-метил-1,3-прэпандиэла в 0

500 M I 5%-нэгэ пэливиннлпирэл1шэна раствэряют в смеси толуол:этанол-3:1 и затем прибавляют 10 мл 5%»ного спиртового раствора эксиэтилированного лаурилового спирта.

Раствор перед применением оставляют стоять.

48 ч в темноте.

Реактив, полученный пропитыванием этими растворами, имеет те же свойства, что и реактив в примерах 1 и 2, Пример 5.Пропиточный растворТ.

10 г гидрохлориаа о-толидина растворяют в ..меси 200 мл 5%-ного водного раствора поливинилпиролидэна и 300 мл этанола и к этому раствору прибавляют 100 мл 10%-ного водного раствора солянокислого лепидона, 100 мл 2 н. цитратного буфера с рН 3, 7 и 100 мл 5%-ного водного раствора лаурилсульфата натрия.

Пропиточный раствор и.

100 мл 1,25%-ного водного раствора поливинилового спирта смешивают с 20 мл 50%ного водного раствора лаурилсульфата натрия.

Пропиточный раствор UI.

40 г сопи фенипизопропилгидроперекиси с

1,4-чиазэбицикло-(2,2,2)-октаном, 60 r

1,4-диазобицикло-(2,2, 2) -октана 20 r твердого поливинилпиролидона в указанной последовательности растворяют в 1000 мл 40% ного раствора поливинилпиролидона в смеси толуол:этанол-2: 1.

Полученный реактив идентичен реактивам в примерах 1 и 2, Формула изобретения

Реактив для определения крови и гемоглобина и биологических жидкостях, содержаший кислотный буфер, хромоген, детергент, активатор пероксидазного действия гемоглобина и органическую гидроперекись, о т л ичаюшийся тем, что, с целью повышения чувствительности и стабильности при хранении, он содержит пленкообразующее вещество, а органическая гидроперекись содержится в форме соли с органическими аминами с константой диссоциации не ниже 8 при следуюшем весовом соотношении компонентов, вес.%:

Пленкэобразуюшее вешество 2,5-25

Соль гидроперекиси 2 -20

Хром оген 0,5- 5

Детергент 0,004-4

Активатор пероксидазного действия гемоглобина О, 1-10

Орган и ческий ам ин 0,2-40

К исл отный б уфе р Остальное.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент Великобритании № 1186968, С ; 01 К 33/16, 1970.