Способ выделения внутриклеточной аминопептидазы

 

О П И С А Н И-Е=

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву

2 (51) М. Кл.

С 07 (7/02

jA 61 К 37/48 (22) Заявлено 29.03.76(21) 2339358 23 04 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Государственным номнтет

Совета Инннотров СССР по делам нзобретеннй н открытнй (43) Опубликовано 05.07.78.Бюллетень № 25 (53) УДК 577.15.07 (088Я) (45) Дата опубликования описания14.06. f3. (72) Авторье изобретения

P. К. Вайткявнчюс, Л. K. Чяпене, Г. Б. Масюлите и Л. М. Антоненкова

Инс:тнтут биохимии AH Литовской ССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ВИУТРИКЛЕТОЧНОИ

АМИНОПЕПТИДАЗЫ ИЗ Всисеейов енЬ66е

Изобретение относится к области энзимологии, а именно к выделению внутриклеточных ферментов, и может быть использовано в ферментной и микробиолегической промышленности.

Известен способ выделения внутриклеточных ферментов, например аминопептидазы, включающий отделение клеток от культуральной жидкости, разрушение клеток, центрифугирование оставшейся массы на высокоскоростной центрифуге, осаждение ферментов,суль-. фатом аммония, диализ и выделение ферментов методом адсорбции при рН 5,8 — 6,5 11).

Однако этот способ трудоемкий, поскольку затруднено центрифугирование, а диализ занимает около 60 ч, выход ферментов низкий

Целью изобретения является повышение выхода выделяемой внутриклеточной аминопептилазы.

Поставленная цель достигается тем, что в полученный после центрифугнрования экстракт добавляют соль или смесь солей алкилтриметиламмония с числом атомов углерода в алифатической цепи от 1О до )6 по 0,4 — 0,5 г на l r белка, экстракт подвергают повторному центрифугированию и в надосадочную жидкость добавляют на 1 г белка по 0,07 — 0,3 r ненонного детергента с гидрофильно-липофильиым балансом 12 — 17.

Предлагаемый способ выделения внутриклеточной аминопептидазы из Bacillus subtilis заключается в отделении клеток от культуральной жидкости, разрушении клеток, центрифугировани и экстракта, в который доба вляют соль илн смесь солей алкилтриметиламмония с числом атомов углерода в алифатической

1О цепи от 10 до 16 по 0,4 — 0,5. r на 1 г белка, повторном центрифугировании экстракта, добавлении в надосадочную .жидкость на l г белка по 0,07 — 0,3 г неионного детергента с гидрофильно-липофильным балансом l2 — l7 и . адсорбции целевого продукта нри рН 5,8—

1о 6,5.

В качестве соли алкилтриметиламмония предпочтительно используют цетилтриметиламмоний бромистый.

Пример. Биомассу Bacillus subtilis отделяют от внеклеточных примесей, взвесь промытых 0,04М NaC1 клеток обрабатывают ультразвуком для. разрушения клеток. Полученные

7470 . мл гомогената центрифугируют при

4000хд в течение 20 мин для удаления крупных взвешенных частиц, при помокни 2М МаОН

95 рН доводят до 6,5, охлаждан>т до 4 С и добав.

6l4ll3

Формула изобретения

Составитель Г. Коннова

Текред Q. Луговая Корректор С. Патрушева

Тираж 559 Г1одписное

Редактор T. Шарганова

Заказ 3641/24

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров C(.CP по делам изобретений и открытий

1 l 3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ляют при перемешивании 58 г цетилтриметнламмония бромистого, предварительно растворенного в 200 мл теплой дистиллированной воды. Смесь перемешивают 10 мин, оставляют на

30 мин при 4 C и центрифугируют при 4000х1 в течение 30 мян. Полученную прозрачную надосадочную жидкость коричневого цвета фильтруют. Получают 4950 мл фнльтрата, содержащего !18 г белка и 25800Е аминопептидазной активности (удельная активность

0,22 Е/мг).

К фильтрату добавляют 200 мл 5%-ного раствора синтанола ДС-10. 5150 мл полученного раствора пропускают двумя порциями по

2575 мл через две колонки диаметром 70 мм и высотой 210 мм, заполненных диэтиламиноэтилцеллюлозой, уравновешенной фосфатным буфером, рН которого 6,5 и ионная сила 0,02 М, содержащим 0,03.М NaCI. После сорбцин каждую колонку промывают 3 л фосфатного буфера, содержащего 0,05 М NaCI, а аминопептидазу элюируют фосфатным буфером, содержащим 0,2 М NaCI. Получают 1618 мл активного элюата, содержащего 3,.1 r белка и 18160Е аммиопептидазной активности (удельная актив ность 5;9 Б/мг. Выход по активности 704%.

Вместо цетилтриметиламмоиия бромистого можно использовать соли илн смеси солей алкилтримети,/1аммония с числом атомов углерода в алифатической цепи от 10 до 16, а вместо синтанола ДС -10: — другие неионные детергенты с гидрофильно-липофнльным балансом 12—

17;

Активность аминопепгидазы определяют по расщеплению 0,5 мл раствора лейцнл-2-нафтиламида при 37 С в 0,05 М цитратвероналовом буфере (pH 8,1), содержащем 0,045 М кобальта азотнокислого. Количество образующегося

2-нафтиламина определяют с помоп1ью красителя Гранатового прочного ГБЦ. За единицу активности (F) принимают количество фермента, расщепляющего за l мин мкмоль лейцил-2-нафтнламнда. Концентрацию белка определяют биуретовым методом.

По сравнению с известным способом выход увеличивается на 30 — 40%.

1. Способ выделения внутриклеточной амннопептидазы из Bacillus subtilis, включающий отделение клеток от культуральной жидкости, разрушение клеток, центрифугирование экстракта и выделение аминопептидазы при рН 5,8—

6,5, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода фермента, в полученный после центрифугнрования экстракт добавляют соль или смесь солей алкилтрнметиламмония с числом р атомов углерода в алифатнческой цепи от 10 до 16 по 0,4 — 0,5 г на г белка, экстракт подвергают повторному центрифугированию и в надосадочную жидкость добавляют на 1 г белка по 0,0? — 0,3 г неионного детергента с гидрофильио-липофильным балансом 12 — 17.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что в качестве соли алкилтриметнламмония использу, ют цетилтриметнламмоний бромистый.

Источники информации,апринятые во внимание при экспертизе:

1. N. М1папшга, J. Matsumura, Т. Jamamoto, f. Fukumoto, «1ntracellular Peptidase

of Bacillus subtilis», 1. Agr. Biol. Chem, № 533, 653, 1969.