Способ определения свободного связанного холестерина в биологических жидкостях
Соков Соеетскнк
637О97 иалистических
Республик (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 07.12.73 (21) 1928101, 31-16i
/1981860, 28-13 (51) Ч. Кл.- G 01 N 33/16 (23) Приоритет 17.05.73 (32) 17.05.72
Государственный комитет (31) P 2224132.3 (33) ФРГ (43) Опубликовано 05.12.78. Бюллстс:1ь М 45 (45) Дата опубликования описания 23.01.70 ло делам изобретений и открытий (53) УДК 612.115 (088.8) (72) Авторы изобретения
Иностранцы
Вольфганг Грубер, Ханс Ульрих Бергмайер, Эрих Бернт;, Александр Хаген, Петер Рошлау, Гюнтер Лат и Клаус Бот ает,; (ФРГ) У
Иностранная фирма
«Берингер Маннхайм ГмбХ» (ФРГ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВОБОДНОГО
И СВЯЗАННОГО ХОЛЕСТЕРИНА
В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики сердечно-сосудистых и ряда других заболеваний.
Известен способ определения холестерпна, основанный на выдерживании свободного холестерина (связанный этерифицированный холестерин предварительно подвергают химическому или ферментативному гидролизу) с ангидридом уксусной кислоть1 и концентрированной серной кислотой (реакция Либермана — Бурхарда) с последующим колориметрическим определением образовавшегося окрашенного соединения
E1)
Однако известный способ не обеспечивает высокой специфичности и точности опр ел ел ен и я.
Целью изобретения является увеличение специфичности и точности определения.
Эта цель достигается тем, что добавляют фермент холестерин-оксидазу и определяют свободный холестерин по количеству поглощенно "o кислорода или выделившейся пере- 25 киси водорода, или по количеству образовавшегося холестенона, а связанный холестерин предварительно переводят в свободную форму путем ферментного или щелочного гидролиза.
Определяют холестерин в таких водных средах как экстракты прод ктов пптанп1!
:кидкости, HBIlpllмер сыворотках.
Предлагаемых: способом определяют как свободньш, так и связанный холестерин, которьш находится в этерифицпрованной форме. Связанный холестерин может оыть определен после предварительного химического или ферментативпого омыления.. имическое омыление производят, например, под действием спиртового раствор:. гидриокиси калия, а ферментатпвное омыление производят эстеразой, преимущественно холестерпноэстеразой, полученной из печени или поджелудочной железы.
Измерение потребления кислорода, количества образовавшихся перекиси водорода или холестенопа может быть произведено с помощью обычных методов.
Подходящими способами для определе—
I!!III потрсбле1шя кислорода являются, напри.1ср, газовая хроматография и деполяризацпо пый способ. Предпочтительнее BcL го пр.1мецять способ поляриметрическог:.
îпрсдслепия с помощью кислородного электрода, поскольку этот способ особенно пригоден для автоматического определения холестсрппа.
Образующуюся перекись водорода можI 637097 Пример 1. Поляриметрическое опре. деление расхода кислорода. Применяют приспособление, которое состоит из реакционного сосуда в виде цилиндрической камеры пз транспарентной пластмассы с внутренним диаметром 143 1ьit и внутренней высотой 220 л1л1. Камера содержит 1.8 л1 г раствора 18 1 лоль иодида калия, 7,5 ли1оль гептамолибдата аммония, 800 льиоль хлорида натрия и 2 У холестериноксидазы в 0,2 л оль буфера фосфата калия рН 6,0. В реакционном сосуде находится детектор, который состоит из кислопод-сенситивного электрода. Детектор свя"-ан с анализатором. На дне реакционного сосуда находится магнитная мешалка. Чепез отверстие для наполнения добавляют 20 лл водного, содержащего холестерин, раствора в качестве пробы. Во время энепгичного вращения магнитной мешалки замепяют уменьшение концентрации кислорода в растворе. Поглощение кислорода, которое наблюдают через 2,5 минуты реакции, от45 50 потеш 1;ометрпчески, пол;.рографпческп 11 колоппметрическп, 3 также ферментатив.1ым способом. Наиболее предпочтителен :,;>срментатпвный способ при использовании каталазы или пероксидазы, поскольку этот способ .;.арактеризуется не только черезвычайной специфичностью II получением достоверных результатов, но и может быть ско.1б широван с основной реакцией прп образовании перек:1си водорода. Особенно подходящим является способ определения с помощью каталазы в присутстьп1п такого 13-дикетона, как например, ацетплацетон и B присутствии таких низ(IIi ОПО- II.,П ПОЛ 3jl, ПКЦЦОП:1Л .ПЫХ ад!.А:-: 1 тш1cc! Определение холестенопа производят с помощью кетореагента, преимущественно с помощью таких производных гидразина, взапмодей1ству1О1цих с кето-группой с обраi IIip330HoB, как например, 2,4дипптрофе11плгидразин. Однако холестепоп может оыть также определен непосредственно измерением интенсивности абсорбции в области 240 кль,0 Опыт был повторен прп примененш1 пробы сыворотки, омыленной с помощью сгп.товой щелочи КОН. Определение дало 1;опцентрацпю 193 лг холестсрина на 100 л.г. Сравнительное значение по Либермана — Бурхарду дало 182 лг/100 л1л. Пример 2. Определение Н2О. 10 г кислого фосфата аммония растворя1от в 100 лл воды и добавлением >",:,,1-пой фосфорной кислоты устанавливают з 13 е.ше рН раствора 7.0. Затем добавляют 10 U каталазы. Полученным таким образом р3c вором смесь 0,2 лл 311етилацгтона и 10 ял метанола дополняют до 100 11л. 7,5 ял полученного таким образом расггора смешивают с 0,5 лл сыворотки плп 0,5 л.1 стандартного раствора холестерина с содержагп ем 200 313 0/q холестер11на. Ал:1квот. содср;к31ций сыворотку пробы, а также с.—.ñc",. .«31ций холестерин пробы, сме II Затем замеряют фотометрическп oGp3зовагшийся краситель прп 405 нл, принп.яая во вппмBBèå значение при отсутствии 1 сагснтов. Со стандартным рас-.вором . олестерина получают стандартную криь, ю, па стандартной кривой концентрация хол;сте ина соотнесена к экстпнкш1и при 405 кл. Содержание холестерпна, содержащего сыворотку пробы, определяют гри псполь"..овании стандарта в качестве стандартной вели п1ны. Е онтрольные определсния по Либерману — Бурхарду дали отклонения окоЛО О g. Г О/ Пример 3. Определение Н202. К 3 лл буфера фосфата калия рН 7 (насыщенный 0 ), который содержит 100 31г /, 2,2-а минобензтиазолппсульфокислоты, добавля1от 100 я,г 20О/О-ного раствора оксиполиэтоксидодекана и 0,02 л.:г (=36 U) раствора пероксидазы, а также 0,02 л1л Н О, (0,02 л1л 30 /о-ного Н О на 100 л1л воды) до удаления восстановленных веществ. Смесь проходит в фотометр при 405 н11 или 436 нл1. Как только реакция подходит к спокойному состояни1о, начинают с 0,01 лл сыворотки (1: 15 разбавлена водой) . Через 10 минут добавляют 0,15 U холестериноксидазы. Через последующие 10 минут отсчитывают разницу экстинкции. Таким образом, однако при применении стапдартного раствора холестерина с содержанием холестерина 200 мг составляют стандартную кривую. С помощью стандартной кривой определяют содержание хол.— стерина пробы сыворотки. Измерения даюг содержание 180 11г /о холестерина. Контрольное измерение по Либерману — Бурхарду дает 185 лг о/О. Пример 4. Определение холестенона. 0,2 .ял сыворотки (1: 10 разбавлена водой) смешивают с 0,05 л1л 20О/О-ного раст4 637097 Составптель С. Маг)!отиг!а Рсд»к-; г О. 1. :-aI:-..-.ë Т! к! с" 8 Р -1! а ко" :; -";т,; 11. Самки !:! . и" ". 1 ., - .. г 1" 1! ПО Госуд3))cTBPIIIIol коми-.с. а СССР по . спам из. О) етеи::;I и открь)тий 1 lо,!оо, !Оск: a,,":,— »ý, . ".! виска": иа5.. д. T:.I!. Харьк, I!i;:сь пред. «Патент» ;,åñòc1?è!:oêcèëa3û. Через 15 минут 2!О гь: рас-,вара, содержащего 1 . ..„О.гь 2,4-дииигрофенилгидразина добавляют в 1 н. соляну о кислоту. Через последующие 30 минут добавляют 1!О лгл воды и замеряют образовавшийся гидразон при 405 н)г в фотоме- " Оцеик!, Проводят и зависимости от стандартной! кривой, принимая во внимание 05разец без ?еагснта. 1,амере;ше можно пр0водить также при 516 нлг после добавления щелочи. Измерение в стандартной (тшшчной) пробе дает 60 «)гг,гс свободного холестерина и 154 I!e со общего холестерина (омыление спиртовым раствором КОН). Сравнительное определение по Либерман . — Бурхарду дало 170 лгг",„, общс: холестерина. Для омыления этерифицированного холестерина (измерение общего холестерпна в сыворотке) смешивают 1 лгл сыворотки. 1 лгл 20", с-ного раствора оксипоьчгэтоксидодскана и 5 ?ял 0,5 н. КОН в 90,го-пом этаноле и нагревают в течение 30 минут, до 0 С. Затем раствор оставляют охла?!.даться, смешивают с 10 )гл 0,1 М раствор сульфата магния и центрифугируют. Отстой (13 дг.г) содержит весь хо","стерни 3 свободном виде. Омьгление этерифицированного холестерина лсберэстеразой или холестериноэсте. разой происходит в результате 30-viинутной инкубацин сыворотки при 37 С и рН 6 — 8. Пример 5. О!2 1!.г clIBopOòê:1 добазляют к 2,5 лгл 0,5 и. буфера фосфата натри) рН 7,5 с 0,4,, оксиполиэтоксидодекана. Определяют экстинкцию при 240 н.)г в подходящем спектрофотометре и начинают реакцию с О!02 л,г (1,5 U) холестеринокспдазы. Чс .сз . 3!и!!у. ы сН033 Оп;?сдсля!От экстинкцию. Концсн-., ац:!я образозавшсгося холестено.! .!.! таким образом холестерииа полут)аЕГСЯ !3 333 1 !и !,!! жл IC 3ÛÌ I! !ЗТОРЫМ 5 изме ..!!c, пр!I учете молярног0 коэффиц - Iò" э стч к! )ч ""»;о !сстс он" ПП 240 . .. . I 3иере:1:!с т))п! )ной пробы дало 58 .. с "., Сзобо.-!ного ?;0 честерина и 10 163;i; с)о общего хо-!Cñòåðèíà (после омытии (ч) Ср - вн))тельное определе !Пе по Либерману — Бурхарду дало 173 1)г,I) общего холсстср; на. Предлагаемый способ обеспсч; зает высокую специф.! н:ость и тс 1!10с!ь определения свободного I связанного хол стс: ина 3 О::IОЛОГИ:)СС:;::; КИДКОСТЯХ 20 Ф о р ?,1 c;I 2 .1 з о о р с т с и н я Сп;;сс0 Оп;?еде.пения свободного li сзя3!" О" 0 О, IЕ ЕО:1;Н) 3 OliOËOÃИ!)ССК. )Х ЖИДкостях, отличà ощпйся тем, что, 25 целью увслпчения спецпфичпости li точНОСТ 1 ОПРЕДЕЛC)1!I× В ОИОЛОГИ IССК 10 ?1;ИДкость .\ооазляют фермент холестерпнокс))дазу и оире.-,сляют свободный 0 .ccòånин ПО КO".:1::ÑÑÒÇ: .-IОГ;101ЦСННОГО »КПСЛОРОДа ИЛ;1 30 выделиьшсйся i!Cpc! IIC!i ВОдОРода, или по колю е тз образовазшегося холестенона, а связ33í! !II холестерин предварительно псрево. ят 3 свободную форму путем ферментного ил.) щелоч:.ого ги.".ро-.иза. зо 1 ic О !Пиl. 1!)1фоэмаци), пвинятыl! НО в;-пма;-ше при экспертизе: 1. Предтеченский В. Е. Руково-,ство по кл)111 .I 1cic!1»1,1IIÎC 1?г)т01?ным исслеДОВаниг):!1. i 96-: с. ?3.
