Ботонд Пенке, Лайош Балашпири, Петер Паллаи, Кальман Ковач, Винце Варро, Янош Лонович, Ласло Bapra, Дьердь Добо, Геза Иваньи, Лайош Ковач, Миклош Лев и Юдит Лев (ВНР)

Иностранная фирма Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр,РТ (BHP) {72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУЛЬФАТА ОКТАПЕПТИДАМИДА

-TE РМИНА JlhHOI О ОК ТА ПЕПТИДА ХОЛЕ ЦИС TOK HHHHIIA HKPEA3HMHHA

L-Aap-L-Тцг-L-Ие1-1.-©у-L-Òãð-L-Net-1.-Аар-4.-РЬеМНе

3 путем взаимодействия защищенного октапептидамида с сульфирующим агентом в растворителе с последующим

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения сульфата октапептида вЂ” терминального октапептида холецистокининпанкреазимина соединения, обладающего биологической активностью.

Известен способ .получения названного сульфата октапептидамида путем сульфирования незащищенного соответствующего октапептидамида концентри- 10 рованной серной кислотой или смесью серной кислоты и бисульфита калия (1).

Продукт при этом получают загрязненным побочными продуктами сульфирования и с низким выходом:(10%). 15

Наиболее близким к предложенному способу является способ получения укаэанного сульфата октапептидамида сульфированием тирозиновой части соответствующего защищенного пептида путем обработки последнего комплексным соединением пиридина с трехокисью се-, ры и последующим снятием защитных групп ацидолизом. Для защиты азота индольной части триптофана используют трет- бутилоксикарбонильную группу.

Удаление этой защитной группы требует продолжительной обработки продукта избыточным количеством трифторуксусной кислоты, что может привести к загрязнению конечного сульфата октапептидамида побочными продуктами реакции.

Выход сульфата октапептидамида, полученного этим способом, невысок и составляет 30% (2) .

Цель изобретения вЂ” упрощение процесса и повышение выхода сульфата октапептидамида вЂ” терминального октапептида холецистокининпанкреазимина, обладающего ценными фармакологическими свойствами.

Это достигается согласно описываемому способу получения сульфата октапептидамида вЂ” терминального октапептида холецистокининпанкреаэимина общей формулы Т снятием защитных групп и выделением целевого продукта, з аключающемус я в том, что в качестве защищенного

659083 октапептидамида используют соединения формулы II.

Я-ASp-Ty вЂ” Ие1 вЂ” 6(,у Trp вЂ” )ah вЂ” Арр вЂ” 13еЦК

I I

9 10Г W где Х вЂ” трет-бутилоксикарбонильн ая, ас,ос-диметил- (3, 5-диметокси ) -бен зиль- 8 ная группа, у вЂ” трет-бутилоксигруппа, W вЂ” гидроксильная группа, For вЂ” формильная группа, в качестве сульфирующего агента ис- 10 пользуют комплекс третичного амина, содержащего по крайней мере одну алкильную группу и трехокись серы, процесс провоцят в диоксане с последующей отработкой полученного сульфа-(5 та гидроокисью щелочного металла и последующим удалением оставшихся защитных групп ацидолизом.

Предпочтительными вариантами являются: использование комплекса-тре- 20 тичного амина с трехокисью серы в 2030-кратном избытке, использование в качестве комплекса комплексного соединения вЂ” N-метилморфолина с трехокисью серы, пРоведение ацидолиза динатриевой соли сульфата оКтапептид-. амид4 обработкой последнего смесью из 70-85% трифторуксусной кислоты, 5-10% меркаптоэтанола, 5-10Ъ воды и

5-10% анизола или меркаптоэтанолсульфокислотой, растворимой в ледяной укЗО сусной кислоте.

Осуществление сульфирования окта-. пептидамида формулы II в укаэанных условиях позволяет получить сульфат октапептидамида формулы 1 с выходом.

77Ъ.

Исходный защищенный октапептид (формулы II) получают постепенным наращиванием пептидной цепи конденсацией аминокислотных фрагментов с 40 использованием известных методов пептидной химии, например азидного, карбодиимидного, метода активированных эфиров и т.п . (3) . Не участвующие в реакции функциональные группы защи- 45 щают известныж защитными группами, которые после проведения реакции могут быть легко отщеплены гидролизом, ацидолизом или другими известными методами, селективно или одновременно. 50

Азот индола триптофановой молекулы защищают формильной группой, поскольку эта группа при проводимом во время синтеза молекулы пептида ацидолизе препятствует образованию нежелательных производных третичного бутила.

Защищенный октапептидамид фор улы 11 обрабатывают раствором комплекса N-метилморфолина и трехокиси серы (взятом в 20-30-кратном избытке) в диоксане или в смеси диоксана в диметилформамиде. Комплекс получают в ре.зультате реакции обмена между хлорсульфоновой кислотой и N-метилморфолином (4). 65

Полученный защищенный сульфат октапептидамида переводят в натриевую соль с помощью водного раствора 2 м эквивалентного едкого натра, затем защитные группы трет-бутилоксикарбонила и трет- бутилоксигруппу удаляют, обрабатывая смесью 70-85 об.Ъ трифторкислоты, 5-10 об.Ъ маркаптоэтанола, 5-10 об.% воды и 5-10 об.% анизола или 3 м раствором меркаптоэтансульфокислоты в ледяной уксусной кислоте. Получают целевой сульфат октапептидамида. Если требуется дополнительная очистка, продукт затем чис тят хроматографией на колонке с сили кагелем с применением для элюирования смеси равных частей этилацетата и смеси пиридина, уксусной кйслоты и воды в отношении 20:б:11.

Получаемый согласно изобретению с высокой чистотой и с высоким выходом октапептидамидсульфатный эфир формулы I по своим характерным физикохимическим свойствам и фармакологическим действиям идентичен с продуктом, полученным по известным методам.

При дозах 2-10 мг/кг, при внутривенном применении на собаках, это соединение вызывает значительное сокращение желчного пузыря и расслабление сфинктера Одди. Продукт можно применять как для диагностики, так и для терапии.

Температуру плавления соединений определяют в аппарате Тоттоли. Тонкослойную хроматографию проводят на пластинках из силикагеля (силикагель по Италю) в следующих системах растворителей: этилацетат-(пиридин-уксусная кислота-вода 20:6:11)=1:1 (1); этилацетат-(пиридин-уксусная кислота-вода 20:б:11)=б:4. (2); этилацетат-(пиридин-уксусная кислота-вода 20:б:11)=8:2 (3).

Пример 1. L-Аспарагил-0-сульфат-L-тирозил-L-метионилглицил-L-триптофил-L-метионил-L-acпарагил-L-фенилаланинамид.

1,6 мл (25 ммоль) хлорсульфоновой кислоты растворяют в 2 мп хлороформа и смешивают при -10 С при слабом о перемешивании с раствором из 3,3 мл (30 ммоль) N-метилморфолина в смеси из 3 мл диоксана и 3 мл диметилфор- мамида. К образованной суспензии через 5 мин добавляют раствор из 1,25 r (1,0 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-р-трет-бутиласпарагил-L-тирозил-L-метионилглицил-N-формил-L-триптофил-L-метионил-L-аспарагил-Ь»фенилаланил. амида в 8 мл диметилформамида. Смесь перемешивают при комнатной температуре 3 ч, затем охлаждают до 0©С при перемешивании, добавляют 5 мл 4 н.едкого натра. Раствор упаривают досуха, остаток растирают с 20 мл охлажденной о Î Ñ воды, нерастворимый продукт отфильтровывают, дважды промы659083 6 вают водой {каждый раз 20 мл), затем

1 один раз 20 мл эфира. Полученный сырой защищенный октапептидамидсульфатный эфир растворяют затем в смеси из 25 мл метанола и 25 мл воды и величину рН раствора поддерживают, добавив 2 мл 4 н. едкого натра, около

8. Через 20 мин раствор упаривают, остаток растирают со смесью 1:1 ацетона и эфира, отфильтровывают и промывают эфиром. Полученный продукт растворяют в охлажденной до 0 С сме.си из 8 мл трифторуксусной кислоты, 1 мл воды, 1 мл анизола и 1 мл меркаптоэтанола, раствор выдерживают

3 ч при 15-20 С и затем при переме 0 шивании вливают в 100 мл эфира.

Получают 0,90 r ?.-аспарагил-0-сульфат-L-тирозил-Ь-метионилглицил-L-, -триптофилметионил-L-аспарагил-L-фе° . нилаланинамида (77% от теоретического); R y {1) = 0,4. В случае необходимости конечный продукт чистят с помощью хроматографии на колонке, содержащей 80 г силикагеля, в качестве растворителя применяют смесь этилацетата, пиридина, ледяной уксусной кислоты и води в соотношении 37:20:

:6:11.

Применяемый в качестве исходного вещества трет-бутилоксикарбонил-р-трет-бутил-L-аспарагил-L-тирозил-L-метонил-N-формил-Ь-триптофил-L"метионил-L-аспарагил-L-фенилаланинамид получают следующим образом:

A. N-трет-бутилоксикарбонил-N

-формил-L-триптофил-Б-метионил-L-аспарагил-L-фенилаланин амид.

22, 34 г (50 ммоль) L-мети онил-ТвЂ”

-аспарагил-L-Фенилаланинамидгидрохлорида растворяют в 200 мл диметилформамида, смешивают с 11,1 мл (100 ммоль) N-метилморфолина и 23,9 г (50 ммоль) N-трет-бутилоксикарбонил-N-формил-L-триптофанпентахлорфенилового эфира. Величину рН раствора регулируют добавкой остального N-метилморфолина до 7-7,5. Через 12 ч реакционную смесь упаривают до 50 мл и при интенсивном перемешивании вливают в охлажденную до -0 С смесь из

200 мя 5Ъ-ного раствора гидросульфата калия и 100 мл не содержащего перекиси эфира. Осажденный продукт отфильтровывают, промывают эфиром и сушат. Получают 26 г чистого трет бутилоксикарбонилтетрапептидамида (723 от теоретического); т.пл..209ОС; (aj = -22 (c=2 в диметилформамиде);

R (2) =О.q 7..

Б. трет-Бутилоксикарбонил-L-метионилглицинпентахлорфениловый эфир.

1,9 r {6,2 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-L-метионилглицина и 1,92 г (7,2 ммоль) пентахлорфенола растворяют в 31 мя диметиЛформамида. Смесь охлаждают до 0 С, .по каплям при перемешивании к ней добавляют раствор

1,41 r (6,85 ммоль) дициклогексилкар5

55 б

65 бодиимида в 6,2 мл диметилформамида и продолжают перемешивать при той же температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь выдерживают ночь при комнатной температуре, затем выпавшую в осадок дициклогексилмочевину удаляют фильтрованием и фильтрат упаривают при пониженном давлении. Остаток растирают с эфиром, фильтруют, промывают небольшим количеством эфира и перекристаллизовывают из 15-кратного количества этанола. Получают 2,19 г трет-бутилоксикарбонил-L-метионилглицинпентахлорфенилового эфира (63,6% от теоретического); т.пл. 169-171 С1

R g= О, 8 (хл ороформ-мет àí on 8: 2 ) .

В. трет-Бутилоксикарбонил-L-метио . нилглицил-N{-формил-L-триптофил-L-мети онил-L-аспарагил-L-фенилаланинамид.

25, 3 r (35 ммоль) N-трет-бутилоксикарбонил-N -формилтриптофил-L-метионил-L-аспарагил-L-фенилаланинамида растворяют в 120 мл раствора 1 н. со-. ляной кислоты в ледяной уксусной кислоте. Через 90 мин раствор упаривают до половины объема и, добавив 500 мл эфира, осаждают тетрапептидамидгидрохлорид. Полученную соль отфильтровывают, промывают. эфиром и сушат °

Получают 20,3.г N формил-L-триптофил-Ь-мЕтионил-L-аспарагил-L-фенилаланинамидгидрохлорида (884 от теоретического); т.пл. 207-209 С.

3,3 r (5 ммоль) указанного. тетрапептидамидгидрохлорида и 2,77 г (5 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-ТвЂ”

-метионилглицинпентахлорфенилового эфира растворяют в 25 мл диметилформамида и смешивают с 1,11 мл (10 ммоль) N-метилморфолина ° Спустя

24 ч реакционную смесь упаривают в вакууме до половины объема, остаток вливают при перемешивании в смесь из 50 мл 5Ъ-ного раствора гидросульфата калия и 30 мл эфира. Осадок отфильтровывают, промывают водой, затем эфиром и сушат. Получают 3,7 г трет-бутилоксикарбонил-L-метионил-1вЂ”

-глицил-N-формил-L-триптофил-L-метиоI нил-L-аспарагил-L-фенилаланинамида (81Ъ от теоретического); т.пл.175179 С; Ry (3) = 0,45.

Г. трет-Бутилоксикарбонил-L-тирозил-1 -метионил-L-глицил-N -формил-L-триптофил-L-метионил-L-аспарагил-L-фенилаланинамид.

3, 65 г (4 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-L-метионилглицил-И -формил-L-триптофил-L-метионил-L-аспарагил-L-фенилаланиламида растворяют в

15 мл раствора 1 н. соляной кислоты в ледяной уксусной кислоте ° Через

30 мин гексапептидамидгидрохлорид осаждают добавкой 300 мл эфира, отфильтровывают, промывают эфиром и сушат, Получают 3,2 г L-метионилглицил-N-формил-L-триптофил-L-метионил1

-1.-аспарагил-L-фенилаланинамидгид659083 рохлорида (94 3 от теоретического); т.пл.130-132 С.

3,2 r (3,77 ммоль) указанного гексапептидамидгидрохлорида и 1, 84 г (4 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-L-тирозин-2, 4, 5-трихлорфенилового эфира растворяют в 25 мл диметилформа- 5 мида и смешивают с 0,9 мл (8 ммоль)

N-метилморфолина. Реакцион ную смесь выдерживают в течение 24 ч, затем упаривают до половины объема и остаток выливают при перемешивании в щ смесь из 50 мл 5%-ного раствора гидросульфата калия и 30 мл эфира.

Осадок отфильтровывают, промывают водой, затем эфиром и сушат. Получают 3,7 r трет-бутилоксикарбонил-L-тирозил-L-метионилглицил-N -формил-L- òðèïòo4èë-L-метионил-L-аспарагил-L-фенИлаланинамида (92о- от теоретического); В f (3) =0,55.

Д. трет-Бутилоксикарбонил-р-трет-бутил-L-аспарагил-T.-тирозил-L-ме20 тионилглицил-N -формил-T -триптофил-1,-метионил-L-аспарагил-L-фенилаланинамид.

3,7 г (3,45 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-L тирозил-1-метионилглицил-N -формил-.1 -тpипwофил-1.-метионил-L-аспарагил-L-фенилаланинамида растворяют в 15 мл раствора 1 н. соляной кислоты в ледяной уксусной кислоте. Через 30 мин„ добавив 30 мл 30 эфира, осаждают гептапептидамидгидрохлорид, отфильтровывают, промывают эфиром и сушат. Получают 3,45 г

L-тирозил-T -метионилглицил-N -ioprmxr-L-триптофил-L-метионил-T -аспарагил-. 3я

-L-фенилаланинамидгидрохлорида (99% от теоретического) .

3, 04 r (3, 0 ммоль) полученного . указанным способом гептапептидамидгидрохлорида и 1,7 г (3,17 ммоль)1 40 пентахлорфенилового эфира трет-бутилоксикарбонил-р-трет-бутиласпарагиновой кислоты растворяют в 20 мл диметилформамида и смешивают с 0,7 мл (6,3 ммоль) метилморфолина. Реакционную смесь выдерживают в течение 24 ч, затем при перемешивании вливают в смесь из 50 мп 53-ного раствора гидросульфата калия и 30 мл эфира. Осадок отфильтровывают,. промывают водой, затем эфиром и сушат. Получают

3,()1 г трет-бутилоксикарбонил-р-трет-бутил-L -ас пара гил-L-ти рози л-L--метионилглицил-N -формил-1-триптофил-ХвЂ”

-метионил-Б.-аспарагилфенилаланинамида (80% от теоретическогo); R f (3) =0,7. 55

Пример 2. L-Аспарагил-О-сульфат-L-тирозил-L-мети онил глицил-L-триптофил-L-мети онил-L-аспарагил-1-фенилал ани н амид .

2, 1 мл (32 ммоль) хлорсульфоновой кислоты растворяют в 2,1 мл хлорофор-. ма и при -15 " при интенсивном перемешивании смешивают с раствором 5,2 мл (47 ммоль) N-метилморфолина в смеси

22 мл диоксана с 5,2 мл диметилформамида. К полученной суспензии добавляют раствор 1,05 r (1,0 ммоль) с(,,k-диметил-(3,5-диметокси) -бензилоксикарбонил-(6-трет-бутил-L-acпарагил-L-тирозил-L-метионилглицил-N -формил-L-!

-ти потофил-L-метионил-L-аспарагил-Ь-фенилаламинамида в 5 мл диметилформамида. Раствор перемешивают 3 ч при комнатной температуре, затем выливают в 100 мл безводного эфира. При охлаждении в ледяной бане (00C) из раствора выпадает осадок. Величину рН суспензии доводят до 3 с помощью 4М раствора едкого натра, Защищенный октапептидамидсульфат-сложный эфир отфильтровывают, промывают небольшим количеством охлажденной воды, сушат.

Полученный зацищенный оКта ептидамидсульфат-сложный эфир растворяют в смеси 3 мл диметилформамида и О мл этанола и рН среды доводят до 8 посредством от 4 М раствора едкого натра.

Спустя 20 мин раствор упаривают, остаток растирают со смесью ацетона с эфиром 1:1, отфильтровывают и промывают эфиром. Защитную группу удаляют по способу, описанному в примере 1. Получают 0,90 г продукта

{77-о от теоретического); R y (1) =0,4, Продукт может быть очищен хроматографированием на колонке, заполненной силикагелем.

Исходный (,,ц,-диметил-(3,5-диметокси)-бензилоксикарбонил-р-трет-бутил-L-аспарагил-L-тирозил-L-метионилI глицил-N -формил-L-триптофил-L-метионил-L-аспарагил-L-фенилал анин амид получают следующим образом.

К раствору 0,5 г (1,3 ммоль) сб,<х,â€”

-диметил-3 5-диметоксибензилоксикарбонил-трет-бутилоксиаспарагиновой кислоты и 0,37 r (1,4 ммоль) пентахлорфенола в 8 мл этилацетата при О С доо бавляют раствор 0,29 г (1,4 ммоль) дициклогексакарбодиимида в 5 мп диметилформамида. Раствор перемешивают

1 ч при 00С и оставляют на ночь при комнатной температуре. Выделившийся дициклогексилформамид отфильтровывают и этилацетат отгоняют при уменьшенном давлении.

Раствор 1,09 г (1,0 ммоль) гептапептидамидгидрохлорида (полученíoro как указано в примере 1Д) в 10 мл диметилформамида добавляют к раствору полученного активного сложного эфира в диметилформамиде и к смеси добавляют 0,22 мл N-метилморфолина.

Реакционную смесь оставляют на 24 ч, затем выливают в смесь 25 мп 5%-ного раствора кислого сульфата калия и

20 мл эфира. Осадок отфильтровывают, промывают водой, эфиром и высушивают, Получают 1,05 r зашищенного октапептидамида (85 В от т еорети чес к ого ); к (3) =0,7

При мер 3. Исходя из 1 25 r (1,0 ммоль) трет-бутилоксикарбонил59083 l0

О, 9 г окт апептидамидсул ъфат а (77% от теоретического); R g (1) =0,4, Продукт может быть очищен хроматографированием на колонке, содержащей

80 г силикагеля по способу, описан° ному в примере 1.

Формула изобретения

1,Способ получения сульфата окта10 пептидамида - терминальнсго октапеп.тида холецистокининпанкреазимина фор" мулы

1-A8p- L-туг-(=не - L вЂ” Glg -L вЂ” тгр !

80 ) . путем взаимодействия защищенного октапептидамида с сульфирующим агентом в растворителе с последующим снятием защитных групп и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощейия процесса и повышения выхода целевого продукта, в качестве защищенного октапептидамида используют соединение формулы Ц

Х-А8у--Туг -Net - 61, у вЂ” 1г р вЂ” Иеа- Agp-РЬеЖИ

I !

g Ter M

-L- let -(;А8 вЂ” (- вЂ” РЬЯН где Х вЂ” трет-бутилоксикарбонильная, c(,C, â€” диметил- (3, 5-димет окси ) -бен зильная группа, у вЂ” трет-бутилоксигруппа, v вЂ” гидроксильная группа, For вЂ” формильная группа, в качестве сульфирующего агента 35 используют комплекс третичного аьяна, содержащего по крайней мере одну алкильную группу, и трехокись серы, процесс проводят в эфире с последующей обработкой полученного сульфата 40 гидроокисью щелочного металла и ггоследующим удалением оставшихся защитных групп ацидолизом.

2. Способ по п.1 о т л и ч а юшийся тем, что комплекс, обра- 45 зованный из третичного амина с трехокисью серы, применяют в 20-30:-кратном избытке.

Составитель В.Волкова

Техред О.Андрейко 1(орректор С,Шекмар

Редактор T. Çàãðåáåëüíàÿ

Заказ 1886/59 Тираж 5 12 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по,делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Рау шская наб., д.4/5

Филиал ППП Патент, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

-)-трет бутил-L-аспарагил-Ь-тирозил-L-метионилглицил-N -формил-L-триптофил-L-метионил-L-аспарагил-L-фенилаланйиамида получают октапептидамидсульфат-сложный эфир по способу, описанному в примере 1. Полученный продукт растворяют при комнатной температуре в 10 мл уксусной кислоты, содержащей 3 моля меркаптоэтансульфокислоты, раствор оставляют на 10 мин, затем выливают в 100 мл эфира, Выпавший в осадок продукт отфильтровывают, промывают 2 порциями эфира по 20 мл и высушивают. Получают

3. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве комплекса амин-трехокись серы применяют комплексное соединение N-метилморфолина и трехокиси серы и в качестве эфира-диоксан.

4. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве гидроокиси щелочного металла используют гидрат окиси натрия.

5. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что ацидолиз осуществляют смесью из 70-85Ъ трифторуксусной кислоты, 5-10% Меркаптоэтанола, 5-104 воды и 5-10Ъ анизола или раствором меркаптоэтансульфокислоты в ледяной уксусной кислоте.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе.

1. Патент ФРГ Р 1922185, кл. С 07 С 103/52, 1975, 2.М.А.О п de tt i, ГР.РРи Ыеь, Е,P. баЪо

Х7.5heehau, и Mlihiarns,áönthåûü of oho1есув1оЫп(п- рапсгеа т п I,7he С-EerminaE dodecgpeptionP.Am.Chem.5oc., #70, 92, с. 195.

3. Шредер Э., Любке К.Пептиды, М., Мир, ч l, 1967, с. 116.

4.Р.3aumjarten,))Ьег cine Methode zur

suLfonier огЯсяплэспег und anorga n sche etoffe, Ber