Способ получения модифицированных ферментов
ОП И
Союз Советских
Социалистических
Республик ю67 1 284 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 23,08.76 (21) 2402352/23 — 04 с присоединением заявки ¹(23) Приоритет
1<л г
C 0 7 С 7/02!I
A 61 К 37/48
Государственный комитет
СССР по делам изобретений и открытиЯ (53) УДК577. ).5.07 (088. 8) ОпУбликованО 30-1279 Бюллетень Йо 48
Дата опубликования олисания30-12.79 (72) Авторы изобретения
Б.N. Куриненко и Н.В. Калачева (71) Заявитель
Казанский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина (54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ
Изобретение относится к области биохимии, а именно к способу получения модифицированных ферментов и может использоваться для получения ферментов, модифицированн.; х как растворимыми, так и нераствориьтпи. солями диазония, в частности для получения ферментов, связанных с растворимыми носителями и иммобилизованных при помощи реакции азосочетания. Иммобилизованные ферменты могут использоваться в качестве катализаторов в химической промышленности в реакторах проточного типа, а ферменты, связанные с растворимьпи носителями помимо использования в качестве катализаторов в химической промышленности могут применяться как биологически активные вещества и лекарственные препараты.
В литературе описаны способы модификации ферментов путем кавалентного связывания их с растворимыми и нерастворимыми носителями (матрицами) .
С этой целью особенно широко используют способы кавалентнога связывания ферментов с различными носителями при помощи реакций ацилирования (алкилиравания), при помощи изоцианатных (иэотиацианатных) групп, галоидциана, цианурхларида и ez o производных или реакции аэосочетания (H .
Связывание фермента с носителем осущфствляется, практически всегда, через аминогруппу диаминомонакарбанавых аминокислот. Исключение составля-ет метод аэосочетания, используя который можно осуществить связывание через акино-, сульфгидрильные-, циклические и гетерациклические группы аминокислот. Эта особенность реакции азосочетания дает воэможность осуществлять связывание ферментов через значительно большее количество точек, по сравнению са способами, в основе которых лежат узко специфические реакции на аминагруппы белков. Многоточечность связывания, как известно, положительно коррелирует са стабильностью связанных ферментов. Недостатком метода азосачетания является его, во многих случаях, низкая эффективность, определяемая количеством свяэаннога с матрицей (носителем) фермента., Известен способ модификации ферментов, включающий получение солей диаэания из соединений, содержащих
671284 аминоакрильные группы „путем ковалеH Tного связывания их с нерастворимой солью диаэония на основе и-аминобензилцеллюлоэы (2).
Обработкой азотистой кислотой (или раствором нитрита натрия н соляной кислоте) аминобензилцеллюлоза превращается н сопь диазония, к которой добавляется растворенный в буфере фермент. После перемешинания и удаления иэ суспензии промыванием не модифицированного (не связавшего— ся с солью диазония) фермента определяется выход конечного продукта.
Выход модифицированной РНКазы и химотрипсина составляет 2,3Ъ и 3,4Ъ соответственно. Столь низкий выход обеспечивает упоминавшееся выше достоинство метода азосочетания, позволяющее осуществлять многоточечное связывание фермента с носителем.
Цель изобретения — разработка способа модификации ферментов ковалентным связыванием с растворимыми и нерастворимыми солями диаэония, позволяющего добиться большого выхода модифицированных ферментов.
Это достигается тем, что н процессе модификации ферментов солями дг.,зония в реакционную смесь добавляют катализатор — акцептор протонов, обычно пиридин, триэтиламин, диэтиламин, или четвертичное аммониеное основание н конечной. концентрации 0,15-5Ъ.
Процесс проводят следующим образом.
Растворимые или нерастворимые соли диазония, например декстраны или соответственно целлюлозу, активированные введением н них аминоарильных радикалов, обрабатынак z раствором NaNOza соляной кислоте при температуре 0-(+2 С) . pH образовавшегося растнора полимерной соли диазония или суспензии, в слу чае нерастворимого носителя, доводят до 3-4. Ферменты растворяют н буфере и добавляют к раствору акцептор протонов или четвертичное аммониевое основание. Смесь фермента с катализатором добавляют при перемешивании к соли диазония и оставляют на 10-14 ч. Конечная концентрация катализатора.-в реакционной смеси 0,15 — 5Ъ. Ковалентно связанные ферменты в необходимых случаях отделяют от несвязавшихся ферментов и акцептора протонов любым доступным
Методом (растворимые коналентно связанные ферменты, например, при помощи гель-фильтрации или ионного обмена и т.д.; нерастворимые— центрифугированием, фильтрованием и дрв) е
Получение модифицированного фермента в присутствии катализатора в 5-10 раз увеличивает выход связан t.ого фермента по белку и н 4 — 7 раэ по акти н 2О 11 г м-аминобенэилоксиметилдекстрана растворяют в 100 мл 0,5 HCE охлаждают до 0-2 С и добавляют 400 мг NaNO Диаэотируют 5 мин, подщелачивают 3,5 н. ИаОН до рН 4,0 25 и к диазотированному полисахариду добавляют 1 г панкреатической рибонуклеазы, растворенной в 75 мл 0,4 M буфера трис-НС0 рН 8,5, содержащего 0,33о опиридина. Смесь оставЗ() ляют на 14 — 16 ч, Несвязанный фермент и пиридин отделяют от продукта реак, ции при помощи гель-фильтрации на сефацексе G — 75 н системе 0,2 M NaCE. Выход связанной рибонуклеазы по белку 9 8Ъ; по активности ЗОЪ. H р и м е р 2. Получение рибонуклеазы, ковалентно связанной с нерастворимой солью диаэония (с м-аминобенэилоксиметилцеллюлозой). К 0,1 г м-аминобензилоксиметилцеллюлозы в 4 мл 0,5 н, HCC npu постоянном перемешинании, добавляли О 00 4 r NaNOz (0 2 С) . Диазотируют 5 мин, подщелачивают 3,5 H. NaOH до рН 4,0 и к диазотированной цел;юлоэе добавляли 0,1 r панкреати =.еской рибонуклеазы, растворенной н О мл 0,2 М боратного буфера рН 8,5 содержащего 0,26Ъ пиридина. Смесь перемешивают в течение 14 — 16 ч и затем несвязанный фермент и пиридин отмывают на фильтре 0,14 М NaCe Выход модифицированной (иммобилизованной) рибонуклеазы по белку 5ОЪ;по активности 22Ъ. 55 При проведении связывания рибонуклеазы в аналогичных условиях, но в отсутствии катализаторов, получают следующие результаты. При связывании рибонуклеазы с растноримым м-аминобензилоксиметилдекстраном выход модифицированного фермента по белку 20Ъ (по активности 8-10Ъ). При связывании рибонуклеазы с 65 м-аминобензилоксиметилцеллюяозой 671284 Таблица 1 0,10 120 0 15 121 0,20 0,50 120 122 1 0 121 5,0 115 7 5 105 10,0 25 40 50 65 выход модифицированного фермента по белку 5Ъ, по активности 3%. Пример 3. Получение связанной рибонуклеазы в присутствии диэтиламина. 1 Условия связывания и соотношение реактивов те же, что в примере 1. качестве катализатора используют диэтиламин конечной концентрации 0,2Ъ, рН реакционной смеси 8,5. Выход связанной рибонуклеазы по белку бОЪ, по активности 25%. Пример 4. Получение связанной рибонуклеазы в присутствии триэтиламина. Условия связывания и соотношение реактивов те же, что в примере 1. В качестве катализатора используют триэтиламин конечной концентрации 0,2%. рН реакционной смеси 8,5. Выход связанной рибонуклеазы по белку 90Ъ, по активности 28%. Пример 5. Получение связанной рибонуклеазы в присутствии четвертичного аммониевого основания, Условия связывания и соотношение реактивов те же, что в примере 1. В качестве катализатора используют четвертичное аммониевое основание конечной концентрации 0,2%, рН реакционной смеси 8,5. Выход связанной рибонуклеазы по белку б5Ъ, по активности 24Ъ. Пример б. Определение верхнего и нижнего пределов концентраций пиридина, каталиэирующего модификацию рибонуклеазы реакцией азосочетания. Определение проводят сравнением выхода модифицированного продукта в реакции модификации фермента диаэотированным м-аминобензиловым спиртом в зависимости от концентрации катализатора. 3 мг м-аминобензилового спирта растворяют в 0,5 мл О, 5 н. НСР, диазотировали на холоду в течение 5 мин добавлением эквивалентного количества NaNO<. Затем смесь подщелачивают до рН 4 3,5 н. раствором NaOH и приливают к 5 мг рибонуклеазы, растворенной в 1 мл 0,2 М трис-HCC -буфера рН 8,5 с пиридином различной концентрации или без него (в контроле). Через определенные промежутки времени 10, 20 и 30 мин из реакционной .смеси отбирают аликвоты по 0,2 мл и приливают к 5 мл 0,2Ъ раствора азида Na в 0,5 í. NaOH. Выход модифицированного фермента определяют по разнице оптической плотности образцов при 350 нм модифицированных с катализатором и в его отсутствии. В табл.1 дана зависимость выхода модифицированной рибонуклеазы от концентрации пиридина. П р и м е ч а н и е. Выход модифицированной рибонуклеазы в отсутствии пиридина принят эа 100Ъ. Таким образом, нижний и верхний пределы концентрации пиридина, ка- . тализирующие реакцию азосочетания равняются .соответственно 0,15 — 5,0Ъ. П р и и е р 7. Влияние пиридина на модификацию различных ферментов реакцией азосочетания. Панкреатическую рибонуклеазу, трипсин и химотрипсин подвергали модификации диазотированным м-аминобенэи.-, ловым спиртом в присутствии катализатора и без него. а). 3 мг м-аминобензилового спирта растворяют в 0,5 мл 0,5 í. НС8,, диазотируют на холоду в течение 5 мин добавлением эквивалентного количеотва NaNOg Затем смесь подщелачивают до рН 4 3 5 н. раствором NaOH и приливают к 5 мг панкреатической рибонуклеазы, растворенной в 1 мл 0,2 М трио-HCP, — áóôåða рН 8,5 с пиридином и без него. Конечная концентрация пиридина 1%. Через 20 мин из реакционной смеси отбирают аликвоты по 0,2 мл и приливают к 5 мл 0,2% раствора аэида натрия в 0,5N NaOH, ! Выход модифицированного фермента определяют по разнице оптической плотности образцов при 350 нм, модифицированных с катализатором и беэ него. б). Условия проведения, количество и соотношение реактивов в реакции модификации аналогичны описанным в пункте а) для панкреатической рибонуклеазы за исключением того, что в качестве аэосоставляющей испольэова ли трипсин. 671284 Формула изобретения Таблица 2 Выход модифицированноге с катализатором фермента,Ъ 20 мин Фермент 1. Панкреатическая рибонуклеаза 122 2. Трипсин. 118 120 3. Химотри псин Составитель A. Бочаров Техреду М.Келемеш Корректор Е, Папп Заказ 8271/49 Тираж 513 Подписное ц!!ИИ!1И Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 1130 35 москва, ж-35 Раушская наб. д, 4 5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проек-тная, 4 Редактор Л. Письман в). Условия проведения, количество и соотношение реактивов в реакции модификации аналогичны описанным в пункте а) для панкреатической рибонуклеазы, за исключением того, что в качестве азосоставляющей использовали химотрипсин. В табл.2 отражено влияние пиридина на модификацию различных ферментов диазотированным м-аминобензиловым спиртом. При ме чан и е. Выходмодифицированных без катализатора ферментов принят за 100%. 1, Способ получения модифицированных ферментов, включающий получение солей диазония из соединений, содержащих аминоарильные группы, их обработку раствором нитрита натрия в кислой среде и взаимодействие полученных сслей диазония с ферментами, отли чающий с я тем,что, с целью увеличения выхода продукта, взаимодействие фермеята с солью диазония осуществляют в присутствии катализатора — акцептора протонов или четвертичного аммониевого основания в конечной концентрации 15 О, 15 — 5Ъ. 2. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве катализатора акцептора протонов используют пиридин, диэтиламин или триэтиламин. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспектива т.т. 1, 2, под ред. Березина И.В„ Антонова В.К.,Мартинека К. Изд-во Московского .университета, 1966. 2. Mitz ., Summaria L.7., Synthesis of biologically active cellulose derivatives Nature 189, 576, 1961 (прототип).
