Способ получения водонерастворимых биологически активных соединений

 

Вс,,„з, — з.

- А- Н - И:. ()689200

О П E

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. сеид-ву— (22) Заявлено 280777 (21) 2513065/23-04 с присоединением заявки Ко (23) Приоритет—

Опубликовано 301180 Бюллетень N 44

Дата опубликования описания 3011,80 (53)М. Кл.з

С 07 G 7/02//

A 61 К 37/48

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 588. 15. 07 (088. 8) (72) Авторы изобретения

В. П. Варламов, А. В.Власов, Г.Е. Банникова, Б.Л.Цетлин и С.В.Рогожин

Ордена Лечича институт элементоорганических соединений

АН СССР и Центральный научно-исследовательский институт хлопчатобумажной промышленности (71) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОНЕРАСТВОРИМЫХ

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЯ

Изобретение относится к биотехнологии и, в частности, к способам получения водонерастворимых биологи- „ чески активных соединений. В качестве биологически активных соединений 5 используют ферменты, нуклеиновые кислоты, нуклеотиды, белки, липиды и т.д. Такие препараты могут найти широкое применение в различных областях промышленности, например, пи- 10 щевой, медицинской, а также в научных исследованиях.

Известен способ получения иммобилизованных соединений с использованием в качестве носителя макропорис- 15 того кремнезема, включающий предварительную активацию носителя $ -аминопропилтриэтоксисиланом с получением аминированного производного, содержащего 0,5 моля аминогрупп на 1 кг íî- 2() сителя (1). Количество иммобилизованного вещества на таких носителях ограничено из-за низкой (ь0,5 ммоль/г) концентрации функциональных групп. К тому же остаточные аминогруппы, не 25 вступившие во взаимодействие с иммобилизованным веществом, придают носителю слабые анионообменные свойства и обуславливают значительную неспецифическую сорбцию кислых белков,3Q

2 нуклеиновых кислот и т.п. Сильно развитая внутренняя поверхность неорганических носителей силохрома, силикагеля, пористого стекла со множеством микротрещин сама также является причиной сильной неспецифической сорбции таких носителей.

Известен способ получения водонерастворимых биологически активных соединений, включающий модификацию кремнеземной основы (пористое стекло, силикагель), обычно предварительно аминированной, путем покрытия гидрофильными органическими полимерами, последующую активацию модифицированного носителя известными приемами (например, обработка бифункциональными реагентами) и взаимодействие носителя с растворами биологически активных соединений, например, с ферментами. Модификацию носителя гидрофильными органическими полимерами осуществляют следующим образом: кремнеземную основу предварительно аминируют g -аминопропилтриэтоксисиланом, а затем к аминированному носителю присоединяют полиэтиленимин (ПЭИ), с помощью глутарового альдегида. В некоторых случаях ПЭИ присоединяют к кремнеземному носителю путем адсорб689200 — CH — CH — СН СН г г соон со-© — сн сн — ся Сн-... г г, СООЯ СОМО(СО,)zNH-@ о &0 -СН Сй — СН CH — 8i 0 — СНг СН вЂ” СНг СН г г г

cH,он си,o-© О)) о-с©-я=и-©

И ции с последующей сшивкой глутаровым альдегидом. К полученным аминированным носителям ковалентно присоединяют полиакриловую кислоту (ПАК), используя водорастворимый карбодимид f2)

Однако получение водонерастворимых биологически активных соединений этим способом имеет ряд недостатков.

После иммобилизации веществ на таких носителях остаются остаточные аминоГруппы, обуславливающие неспецифическую адсорбцию кислых белков и нуклеиновых кислот. Это явление крайне нежелательное, особенно при иммобилизации соединений для биоспецифической хроматографии. Полученйе иммобилизованных препаратов этим спосо- 1% бом, как правило, многостадийно. Функциональное разнообразие получаемых носителей также ограничено.

Целью предлагаемого способа является улучшение качества целевых про- Я дуктов и упрощение способа их получения. Укаэанная цель достигается за счет того, что кремнеземную основу при 55-65оС подвергают действию ионизирующего излучения с мощностью дозы 40-100 рад/с в присутствии паров виниловых мономеров при давлении 35-400 мм Hg c последующей, в случае необходимости, активацией привитых полимеров для образования реакционноспособных групп и взаимогде L — иммобилизованное соединение 45 липид, Фермент, нуклеотид и т.д.

Улучшение качества иммобилизованных биологически активных соединений достигается, во-первых, за счет увеличения емкости. Концентрация функциональных групп для иммобилизации достигает 4 ммолей на грамм. носителя, что в 8 раз превосходит концентрацию функциональных групп на обычных кремнеэемных носителях. Повышение 55 емкости не так существенно при иммобилизации белков, но очень важно ,)при иммобилизации низкомолекулярных лигандов (нуклеитидов, аминокислот и др.) для аффинной хроматографии.

Улучшение качества иммобилизован- 60 ных биологически активных соединений достигается также отсутствием в полученных препаратах неспецифически сорбированных белков и нуклеиновых кислот. Неспецифическая сорбция сыворо- 65 действем полученных носителей с растворами биологически активных соединений обычно при 0-20оС в течение

2-20 ч.

Согласно изобретению способ получения водонерастворимых биологически активных соединений с улучшенным качеством целевых продуктов заключается в том, что кремнеземную основу модифицируют гидрофильнымн органическими полимерами. Модификация достигается за счет того, что носитель подвергают при 55-65оС обычно в течение 2-10 ч действию ионизирующего излучения с мощностью дозы

40-100 рад/с в присутствии паров виниловых мономеров при давлении 35400 мм Hg. Полученный модифицированный носитель, в случае необходимости дополнительно активируют известными приемами, обычно путем о6работки бифункциональными реагентами, в качестве которых используют или диамины, или диальдегиды, или дихлорангидриды, и полученный носитель подвергают взаимодействию с растворами биологически активных соединений. В качестве биологически активных соединений обычно используют ферменты, лиганды, нуклеотиды.

Получаемые водонерастворимые биологически активные вещества содержат звенья следующей структуры: точного альбумина при рН 7,4 на таких носителях в 5 раз меньше, чем для исходного макропористого кремнезема и в 10-20 раз меньше, чем у кремнеземных носителей, получаемых через аминопропилпроизводное или через ПЭИ.

Низкая неспецифическая сорбция на получаемых сорбентах объясняется понижением свободной энергии поверхности в следствие сглаживания внутренней поверхности привитыми органическими полимерами.

Положительный эффект описываемого способа состоит в том, что:

1. Способ дает высокий выход иммобилизованногo продукта (oco6pHHQ для низкомолекулярных лигандов), так как концентрация активных групп на носителе достигает 2-4 ммолей на грамм.

Например, при иммобилизации уридин

5-монофосфата фосфодиэфирным методом количество иммобилизованного нуклеоти689200 да достигает 20 мг на мл сорбента, на, содержащего 50 мг модифициа как на органических носителях рованного фосфатидилхолина при С типа сефароэы эта величина почти на находятся карбоксильн ру ьнная г ппа, акпорядок по я ок ниже. тивированная Н-оксисукцинимидом) .

2. Использование для иммобилизации Реакционную массу и р е емешивают при мп ат е 20 ч. По оконмных носителей с привитой поли- комнатной те ер ур нт и омывают хлоакриловой кислотой снижает неспецифи- чании реакции сорбен р ческую сор цию кислых б х белков и нукле- роформом, метанолом и высушивают. лот. Неспецифическая сорб- Количество связанного лиганда составиновых кислот. ет 17 мг на 1 г носителя. ция бычьего сывороточного альбумина ляет 17 мг на б фере РН 7 4 на та- Полученный биспецифический сорменьше чем у 1О бент опробован для выделения липидких носителях в 5 раз меньше, чем у я егося белка (ЛПБ). Сорбент

".о ного макропористого кремнезема переносящегося белка исходног и в 10-20 раз меньше, чем у кремне- оказался весьм фф ных носителях, получемых через была достигнута степень селективносземных носителях, аминопропилпроиэводное. Неспецифи- ти, равная ческая сор ция денат б урированных фраг- >$ адсорбированного ЛПБ в процентах а со би ованного

ДНК (линой 500 пар нукле- к общему количеству адсор иро ментов Д длино

) и и H 6 0 на таких носите- белка в процентах) и выс

) сокая степень вная 20 (отношение удельлях в 10-15 раз меньше, чем на крем- очистки, равная 0 ( ной активности ЛПБ после десорбции с неземных носителях непокрытых полити ЛПБ мерами и не превышает — оптич с2-3 о тичес- О носителя и удельной активности и и Х = 260 нм. в исходной белковой фракции). Попытких единиц при = 2 нм.

3. Данный способ дает возможность ка выделить ЛП на ммобилизовать биологически актив- но присоединенном к аминопропилсилоиммобилизовать и оь была неудачной. В этом случае ные соединения на органонеорганичес- хрому, степень селективности составляла ких носителях, содержащих практичес1 3.

1 8 а степень очистки только ки любые отнотипные (в зависимости г ппы. НаI

Пример 2. Носитель (см.пр.

1 (. .1) от взятого мономера) группы. аме п и полимеризации акриловой суспендируют в пример, при поли

200 мг 1-циклогексил-3-(2-морфолинокислоты получают карбоксильные групэтилкарбодиимида мето-р-толуолсульфопы, пы и и полимеризации винилацетата чн е 3О ната)(водорастворимого карбодиимида), после омыления получают вторичные т Н 4 5-6 0 и прибавляют

ые г ппы при полимеризации поддерживают РН 4, —, и при ав спиртовые группы, пр т 100 мг панкреатической рибонуклеазы. этиленгликоль метакрилата получают

Реакционную смесь перемешивают на каперцичные спиртовые группы и т.д. р 0-5 С ечение 4 ч. ВодоНижеследующие примеры служат чалке при — в те е

ываемого способа. 35 нерастворимый продукт отмывают на иллюстрацией описываемого спосо а. ильт е 1 МйаCI и водой до отсутствия

4 рим (),детектируемых количеств белка в проР емнезем — силохром (30 г) помешают мывках. Водонерастворимый продукт сов стеклянную ампулу и откачивают

-3 держит мг е

40 . г белка на грамм носитедо остаточного давления 10 мм Нд

И б лизованный препарат испольпри многократном замораживании и зован для,обработки белковых дрожжеразмораживании. Носитель в ампуле

ЬО вых экстрактов с с целью расщепления облучают — Co в течение 2-х ч содержащихся та я там нуклеиновых кислот при мощности дозы 40-50 рад/с в придо коротких ол х олигонуклеотидов. Один сутствии паров акриловой кислоты. п г.рамм иммо или б изованного препарата

Роводл Р -65 С и при давлении паров акриловой кислоты кислоты (до с (о содержания кислотораст35-40 мм Нд. Полученный носитель воримой доли и и 80-90%) содержашиеся отмывают кипяшим метанолом до посв г дрожже

50 ожжевой биомассы. В течетоянного веса. Получают производное

15Ъ 10 клов работы активность им1 с содержанием углерода до мобилизованного фермента снижается с концентрацией карбоксильных групп на 20до 3 молей на грамм носителя. К производному 1 в 500 мл сухого хлороформа добавляют 9 мл хлористого тио- (4 r), полученное на основе пориснила, 0,5 мл диметилформамида и кипя- того стекла (см,пр.1), суспендитят реакционную массу у 2 ч при пере- рунт в 100 мл абсолютного метанола, мешивании. Продукт промывают на фильт насышенного НС1, и кипятят 2 ч. Проре сухим х р ло оформом суспензируют мывают метанолом (500 мл), суспен.Т Ф в 500 мл сухого хлороформа, добав- дируют в 100 мл абсолютного Г ляют 300 мл этилендиамина, 18 мл три- содержащего 1 r Li Ale и кипятят этилами а мина и кипятят 3 ч при переме- фО при перемешивании 8 ч. Полученный шивании. Полученный носитель тща- носитель промывают ГФ ( тельно промывают на фильтре хлорофор- эфиром ( м (200 мл) и высушивают на мом, ацетоном, водо,, ац ой а еточом. Отби- фильтре ацетоном. Полученный носи2 олученного сорбента и сус- тель (2 r ) суспендируют в 10 мл воды ляют 800 мг пендируют в 10 мл хлористого метиле- 65 при РН 5,5-6,0, добавляют 8

+" v

6893t)0 г и ереьтре поглощеоримый еотида

Формула изобретения

Составитель А.Бечаров

Техред Е.Гаврилешко Корректор Г ° Решетник

Редактор С.Хейфиц

Заказ 9222/72 Тираж 495 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, _#_-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 водорастворимого карбодиимида

200 мг уридин 5 -монофосфата. П мешивают 4 ч и отмывают на фил

1 ММаС! и водой до отсутствия ния при % =260 нм. Водонераств продукт содержит до 50 мг нукл на грамм носителя 20 мг/мп носителя и стабилен при комнатной температуре в высушенном состоянии.

Пример 4. Силикагель (30 г) помещают в стеклянную ампулу и откачивают до остаточного давле- lo ния 10 мм Н9 при многократном замораживании и размораживании. Носитель в ампуле облучают на установке ТРЦ-3А рентгеновскими лучами в течение 10 ч с мощностью дозы 90-100 рад/с в присутствии паров винилацетата при 5560 и при давлении паров 350-400 мм Hg.

К полученному .носителю (10 г) в 50 мл сухого метанола добавляют .раствор метилата натрия, приготовленный растворением 0,6 r металлического натрия в 9,4 мл сухого метанола, и кипятят при перемешивании 1 ч. Затем промывают на фильтре метанолом, высушивают, суспендируют в 200 мл абсолютного хлороформа, содержащего 15 r и-нитробен.зоилхлорида и 5 мл триэтиламина, и кипятят 2 ч при перемешивании. Промывают на фильтре хлороформом, ацетоном, водой, ацетоном. Полученный носитель суспендируют в 100 мл воды, 30 содержащей 10 мл пиридина, добавляют

10 г Ма

2,5 н HCI. Реакционную массу охлаж- 35 дают до +5 С, добавляют 840 мг Иап01 и перемешивают при +5 C на холоде в течение 30 мин. Промывают на фильтре водой, 0,1 М фосфатным буфером рН 8,0 и суспендируют в 5 мл того 4р же буфера, содержащего фермент экзонуклеазу А5 (1 мг/мл). Инкубируют

2 ч при 0-5оС, затем промывают на фильтре 1 М NaCl и водой до отсутствия белка в пройывках. Иммобилизованный препарат обладает активностью до 1000 ед.акт. на 1 г препарата (2 мг белка на 1 грамм препарата).

Одного грамма иммобилизованного пре-, парата достаточно для превращения

0,5 г РНК за 18 ч в гидролизат, содержащий 60-70% нуклеозид 5-монофосфатов. В течение 10 циклов работы активность иммобилизованного фермента снижается на 25-30%.

1. Способ получения водонерастворимых биологически активных соединений, включающий модификацию кремнеземной основы путем покрытия гидрофильными органическими полимерами, последующую, в случае необходимости, активацию модифицированного носителя и обработку полученного носителя растворами биологически активных соединений, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения качества. целевого продукта, кремнеземную основу модифицируют при 55-65 С действием ионизирующего излучений с мощностью дозы

40-100 рад/с в присутствии паров виниловых мономеров при давлении 35400 мм Hg.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю шийся тем, что в качестве биологически активных соединений используют ферменты, липиды, нуклеотиды.

3. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что активацию модифицированного носителя осуществляют бифункциoHальными реагентами.

4. Способ по п.1, о т л и ч а ю шийся тем, что в качестве дифункционального реагентов используют или диамины, или диальдегиды, или дихлорангидриды.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

9455741, кл. В 01 J 11/00, 1975.

2. G,Р; Royer, G.М.Green, В.К.Sinha "Rigid SUpport materials

for the immobilization of enzymes", Macromol. Sei., Chem, A 10, 1-2, 289-.307, 1976 (прототип).