Способ получения оптически активных аминокислот

 

li> . Д .. E

))

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскик

Социапксткческкк

Респубпмк iii 73() 682 (6l ) Дополнительное к авт. свкд-ву (22) Заявлено 04.01.76 (21) 2307174/23-0 (5() Я. Кл.

С 07 С 101/02

А 61 К 31/195 с присоединением заявки И

Государственный комитет (23) Приоритет

Опубликовано 30.04.80. Бюллетень J% 16 (53) УДК 547.233. .07 (088 8) tI0 делам изобретений в открытий

Дата опубликования описания 30.04.80 (72). Авторы изобретения

В. Э. Калис, B. А. Фелднере и Д. Я. Лауцениеце (7!) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОПТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ

AN ÈÍOÊÈÑËÎÃ

Изобретение относится к способам получения оптически активных аминокислот, широко применяемых в качестве пищевых и кормовых добавок, в медицинской промышленности и сельском хозяйстве. 5

Известны различные способы получения оптически активных аминокислот путем асимметрического гидролиза рацемических

М -ациламинокислот с помощью ацилазы, о иммобилизованной на различных органических или неорганических носителях засчет адсорбции или ковалентного связывания, или включением в полимерные материалы, 15

Известен способ получения оптически активных аминокислот с использованием ацилазы, иммобилизованной на анионообменной смоле (1 .

Недостатками этого способа являются низкая скорость процесса, относительно низкий выход (, -аминокислот, исключительная сложность получения иммобилизованной ацилазы и др.

Известен также способ получения оптически активных аминокислот асимметрическим гидролизом рацемических N— ациламинокислот с помощью ацилазы, иммобилизованной в полупроницаемом полимере — полиакриламиде (2j .

Согласно этому способу в 300 мл колбе смешивают 1 мл раствора ацилазы (7 мг/мл), 2 мл раствора крахмала и 2 мл раствора мономеров акриламида и N, g -метиленбисакриламида. Смесь замораживают слоем на стенках колбы

О при ее вращении при -80 С и в замороженном состоянии облучают радиоактивным кобальтом, после чего лиофилизируют. Полученный слой иммобилизованной ацилазы размельчают, .помещают в разбавленный раствор рацемической Й— ациламинокислоты (0,1 М ацетилметионина) и при 37 С осуществляют асиммео трический гидролиз последней при встряхивании смеси. Скорость гидролиза, те. активность иммобилизованной ацилазы

30

3 73 достигает 39,2-46,7% скорости, обеспечиваемой исходной ацилазой.

Недостатками этого способа являются сложность процесса, обусловленная сравнительной продолжительностью и сложностью получения иммобилизованной ацилазы, пониженная скорость гидролиза ввиду низкой активности иммобилизованной ацилазы; ограниченный срок службы дефицитного полимерного материала вследствие невозможности замены фиксированных в массе полиакриламида деактивированных молекул ацилазы на активные, трудность осуществления в увеличенном масштабе ввиду лимитирующей стадии радиополимеризации, Е ель изобретения — упрощение и интенсификация процесса.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе получения оптически активных аминокислот путем асимметрического гидролиза рацемических

N -ациламинокислот с помощью иммобилиэованной полупроницаемым полимером ацилазы, используют ацилазу, ограниченную от субстрата в полости из полупроницаемой мембраны, например из целлофана, со средней величиной пор не более

35-4-0 А.

Способ получения оптически активных аминокислот заключается B следующем.

Изделие из полупроницаемой мембраны, обычно используют трубку или мешок из целлофана, со средней величиной пор не более 40 A заполняют водной суспензией или раствором сырого или очищенного ацилазного препарата. Заполненное изделие, находящееся в покое или используемое для механического перемешивания, выдержйвают в покоящемся или перемеши ваемом растворе М -ациламинокислоты

О при постоянной температуре не выше 50С, преимущественно при 37 С. Этот процесс продолжают до тех пор, пока концентрация возникающей свободной аминокислоты не достигает половины концентрации исходной рацемической Й -ациламинокислоты, и далее не возрастает.

0682 4 или суспензией ацилазного препарата, можно испольэовать не менее месяца, Средний размер пор полупроницаемой полимерной мембраны должен быть таким, чтобы сквозь них легко проходили молекулы Я -ацетиламинокислоты и аминокислот, средняя длина которых около

10 Л; но не проходили молекулы ацилазы (со средним молекулярным весом

10, т.е. с размерами 50-60 М и более).

Слишком малый размер пор затрудняет диффузию субстрата через мембрану к ферменту, слишком большой средний размер пор приводит к проскоку молекул ацилазы через увеличенное число случайных больших пор, уже пропускающих молекулы ацилазы.. Поэтому средний размер пор полимерной мембраны не должен о существенно превышать 40 А.

Пример 1. 21 4 мг ацетонового порошка почек свиньи споласкивают дистиллированной водой (5 мл) и помещают .внутрь целлофановой трубки длиной 40 см и диаметром 2,5 см. Среднюю часть трубки, содержащую суспензию ацетонового порошка, зигзагообразно помещают в сплющенном состоянии на дно эксикатора диаметром 12 см, почти полностью прикрывая дно. Расстояние между поверх-. ностями сплющенной целлофановой трубки, между которыми находится суспензия ацетонового порошка, 1-4 мм. На дно эксикатора с целлофановой трубкой заливают 17,2 мл 0,5 М рацемического

N--auez mve aoama с 3,6 10 N ацетата кобальта, который образует слой жидкости высотой около 3 мм. Эксикатор термостатируют при 36-40 С, прослежио вая концентрацию метионина с помощью нингидрида, до завершения реакции (0,25 М метионина). Раствор прореагировавшей реакционной смеси собирают, на целлофановую трубку с ацилазной сус пензией вновь наливают такой же объем субстрата и процесс втечение месяца повторяют еще 2 раза с 17,2 мл 0,5 М рацемического ацетилметионина, а затем еще 5 раэ с 34,4 мл,Скорость реакциисоИз прореагировавшей реакционной смеси целевые продукты выделяют известными приемами, а изделие с раствором или суспензией ацилазного препарата используют таким же образом ещенесколько раз (не менее 2) для осуществления асимметрического гидролиза новых порций рацемической Н -ациламинокислоты. Изделие из полупроницаемой мем« браны,наполненное 1 раэ раствором

Б ответствует примерно 50%-ной активности исходной ацилазы.

200 мл собранных реакционных смесей обрабатывают активным углем, фильтруют и упаривают в вакууме. К остатку приливают примерно 30 мл абсолютного спирта.

Выпавший осадок отфильтровывают, промывают спиртом, эфиром и сушат. Выход

5 г I„-метионина (60%), Йфо = +22,9С (С 1; 5 н НС1).

5 .7 306

Пример 2 . 5 мл раствора ацилазы почек свиньи ОЗХР (с общей ак-... тивностью на l млраствора4750 мкмоль/ч

-метионина при использовании рацемата GHeTHJIMBTHoHHHG в качестве субстрата) помещают в целлофановый мешочек, сплющенная рабочая часть которого 5х5 см и общая рабочая поверхность 50 см

Мешочек укрепляют на изогнутом конце стеклянной палочки шириной 4 мм, исполь-I0 зуемой в качестве мешалки, Огношение общей поверхности заполненной раствс)ром ацитазы нижней части мешочка к объему раствора ацилазы в нем 8: 1 (см /мл) ..

В. стакан на 250 мл наливают 15

50 мл раствора 0,5 М раствора рацемического ацетилаланина с рН=7,2 с

3,6.10 М ацетата кобальта, термостатируют стакан при 37 С в термостате, О вводят в раствор ацетилаланина мешалку с ацилазным мешочком, которую приводят в движение. Процесс при размешивании со скоростью около 40 об/мин продолI жают при 37 С до завершения реакции (примерно 3,5 ч, при 0,25 М концентрации аланина, оцениваемой с помощью нингидрина). Опыт со свежей порцией

0,5 М ацетилаланина повторяют еще раз с тем же результатом. Иммобилизованная ацилаза функционирует с, сохра30 некием 86% активности исходной, так как в смеси 1 мл того же раствора ацилазы с 10 мл 0,5 М ацетилаланина реакция при 37 С завершается эа 3 ч.

О

Пример 3. Хранившиеся в замо- 35 роженном состоянии, почки свиньи

0,5 кг гомогенизируют в течение 5 мин в размельчителе тканей. Такой же, как в примере 2, мешочек с 1 r полученной размельченной биомассы свинных почек

40 с общей ацилазной активностью 7200 мкмоль/ч L -метионина прогревают в погруженном состоянии с 25 мл такого же, как в примере 2, рацемического

0,5 N аце гилаланина 20 ч при 37 С.

О 45

Реакцию завершают. Опыт с новой порцией ацетиаланина с тем же результатом повторяют еще раз.

К объединенным двум порциям прореа50 гировавшего раствора ацетилаланина

50 мл приливают объединенный раствор прореагировавшего ацетилаланина, полученный в примере 2. Полученный общий раствор прореагировавшего ацетилаланина

55 (300 мл) упаривают в вакууме при о

45 С до сиропообразного состояния.

После охлаждения до комнатной температуры добавляют 30 мл этилового спирта

82 6 и смесь оставляют на 16 ч при +4 С для

I кристаллизации. Кристаллы 1. -аланина отфильтровывают, промывают спиртом и о сушат при 50 С до постоянного веса, Быхов L -вовнинв о,4 г (81%)g

= +14,2 С (C=l; 5 н.НСВ), Пример 4. Один конец влажной целлофановой трубки длиной около 30см, ширина которой в сплющенном состоянии

5,5 см, завязывают в узел, который не пропускает воду. В целлофановую трубку помешают кусок 5к17 см сетки примерно с 100 ячейками на 1 см, образованными капроновыми нитями толщиной около

0,2 мм. Затем наливают в целлофановую трубку 10 мл водного раствора ацилазы почек свиньи ОЗХР (4 мг/мл) с общей ацилазной активностью 16000 мкмоль

L -метионина/ч, удаляют по воэможности пузыри воздуха иэ пространства целлофановой трубки с сеткой, куда налит раствор ацилазы, и завязывают на узел второй конец целлофановой трубки. В стеклянную хроматографическую камеру с пришлифованной крышкой с плоским ровным дном 8,5Х18,5 см и высотой

20 см помещают на дно кусок 7,5 17,5см такой же капроновой сетки, наливают

100 мл 0,5 М рацемического ацетилвалина с рН=7,2, установленным с помощью Na0H, и помещают на дно подготовленную целлофановую трубку с раствором ацилазы. Камеру выдерживают в термостатируемом сушильном шкафу при 3739 С, прослеживая ход реакции по увели0 чивающейся концентрации валина. Через

22,5 ч такого прогревания реакционную смесь упаривают в вакууме. K остатку приливают примерно 20 мл спирта и оставляют на 16 ч при 4 С для кристаллизации. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают спиртом и высушивают. Выхоа Ь -вниихи 2,24 г (76,4%),(сф

= +25,5 С (C=0,72; 5 н. НС ).

Пример 5. В такой же-хроматографической камере с такой же завязанной целлофановой трубкой с капроновой сеткой, с 10 мл такого же раствора ацилазы, как в примере 4, при 37-39 С

О прогревают 100 мл 0,5 М рацемического ацетилсерина с рН 7,2 в течение

15 ч. Затем реакционную смесь упаривают в вакууме при 50-60 С до сиропообраэб ного состояния. Добавляют примерно 20 мл этилового спирта. Для полной кристаллизации 1 -серина смесь оставляют при температуре 4 С на 10=15 ч. Осадок

О отфильтровывают, промывают 10-15 мл

7306 холодного этилового спирта,, сушат при температуре 60-70оС. Выход 1,89 г (72%) (of =+14,6 С (С=2; 5 н. НСС).

При осуществлении предлагаемого способа значительно упрощается процесс получения иммобилизованной ацилазы, который сводится к заполнению изделий из полупроницаемой мембраны раствором или суспензией ацилазного препарата, и нет потребности в дефицитных реактивах и аппа i 0 ратуре; значительно ускоряется процесс, так как скорость гидролиза в присутствии иммобилизованной ацилазы т.е. ее активность достигает 80-86% скорости, обеспечиваемой исходной ацилазой. Кроме то- 15 го, при снижении ацилазной активности ацилазы, заключенной в ограничивающей полости, например в трубке или мешке, первоначальную активность восстанавливают добавлением свежей порции фермента. 20

Это значительно увеличивает срок службы соответствующего изделия из полупроницаемой мембраны.

82 8

Формула изобретения

Способ получения оптически активных аминокислот путем ассиметрического гидролиза рацемических N -ациламинокислот с помощью иммобилизованной полупроницаемым полимером ацилазы, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения и интенсификации процесса, используют ацилазу ограниченную от субстрата в полости из полупроницаемой мембраны, например из целлофана, со средо ней величиной пор не более 35-40 А.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Японии _#_ 74-125585, кл. 36(2), опублик. 05,12.74.

2. Камаshirna К., Umeelo К,, 1щгпоЬ!—

И сЖоп ok enz rnes Ь radipoQ rner izabon oj acr vQarnide. BiotechnoQ,авд Bioe ., 16, N, 5, 609, 1974. (прототип).

Составитель С. Плужнов

Редактор A. Долинич. Гехред М. Кузьма Корректор Ю. Макаренко

Заказ 1449/7 Тираж 495 Подписное, БНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4