Способ получения элимоклавина

 

Йм г вам т н О- т л н и ч О о вмй йе

4»ебд%@тбкй МьА

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 26.12.78 (21) 2706000 28-13 с присоединением заявки Ке (51) М Кл з

С 12D 13/00

Государственный комитет

СССР по делам изобретеиий и открытий (23) Приоритет (43) Опубликовано 15.12.81. Бюллетснь Kе 46 (53) УДК 663.11(088.8) (45) Дата опубликования описания 15.12.81 (72) Авторы изобретения

А. Г. Козловский, М. У. Аринбасаров, T. Ф. Соловьева, СССР, Ангелов Теодор Иванов, Слокоска Людмила Симеоновна, Ангелова Мария Богомилова и Величков Иван Григоров, НРБ (71) Заявители Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР и

Институт микробиологии Болгарской Академии наук, НРБ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭЛИМОКЛАВИНА

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения элимоклавина.

Элимоклавин- (8 - гидроксиметил-Лз е-эрголен) — один из важнейших представителей группы клавиновых алкалоидов, относящейся к классу эргоалкалоидов (алкалоидов спорыньи). Элимоклавин обладает ярко выраженной биологической активностью и может найти применение в медицине.

Известен способ получения элимоклавина, предусматривающий глубинное культивирование гриба-продуцента при аэрации на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли, выделение и очистку целевого продукта (1). В качестве продуцента используют гриб, выделенный из склероций

Peninisetum tiphoideum Rich, который выращивают в течение 27 дней на питательной среде следующего состава, г: сахароза 100; сукцинат аммония 10,1; Са (NO3) г 1,0;

КНгРО» 0,25; MgSO4 7НгО 0,25; КС1 0,125;

FeSO4 7НгО 8,34; ZnSO» 7НгО 3,44 мг; вода водопроводная до 1 л. При этом выделяют смесь алкалоидов, содержание элимоклавина в которой составляет 42с/ .

Недостатком известного способа является длительность процесса культивирования.

Цель изобретения — сокращение времени культивирования.

Указанная цель достигается тем, что в качестве продуцента используют штамм

Claviceps sp. ИБФМ-F-401, который выращивают на питательной среде следующего состава, г/л:

Сахароза 250 †3

Лимонная кислота 10 — 15

Дрожжевой экстракт 0,1 — 0,2

КНгРО4 0,25 — 0,50

MgSO4 7НгО 0,025 — 0,50

ZnSO4 ° 7НгО 0,003 — 0,007

FeSO» 7НгО 0,005 — 0,010

КС1 0,1 — 0,2

Вода водопроводная До 1 л рН среды доводят концентрированным аммиаком до 5,2. Культивирование штам20»a Claviceps sp. ИБФМ-F-401 ведут в течение 10 — 12 дней.

Выделение элимоклавина из культуральной жидкости осуществляют известными методами: одноступенчатой экстракцией с

25 последующей кристаллизацией и очисткой методом колоночной адсорбционной хроматографии.

Гриб Claviceps sp. ИБФМ-F-401 получен из Института микробиологии Болгарской

30 Академии наук и хранится в коллекциях

7350!О

250 — 300

10 — 15

0,1 — 0,2

0,25 — 0,50

0,25 — 0,50

0,003 — 0,007

0,005 — 0,010

65

3 культур данного института (Claviceps sp. ср. II) и Института биохимии и физиологии микроорганизмов AH СССР (Claviceps sp.

ИБФМ-F-401) .

Морфологические и физиолого-биохимические признаки гриба Claviceps sp, ИБФМ-Г-401

Колонии на глюкозокартофельноы агаре на 14 сутки культивирования достигают

50 мм в диаметре, белые, обратная сторона колоний пурпурного оттенка, пигмент такого >ке цвета диффундируст в агар. Растущий край — ровный, поверхность колонпп— войлочная. Центральная часть колошги с возрастом приобретает бежево-пурпурный оттенок, становится бархатистой.

При культивировании на лабораторной среде (Тг) состава, г: сахароза 100; DL-аспарагин 5; Са (NO ) г 4НгО 1; КН РО» 0,25;

MgSO».7Í2 0,25; дрожжевой экстракт 0,1;

KCI 0,12; FeSO» 7НгО 0,015; агар-агар 20; вода водопроводная до 1 л; НСI до рН среды 5,2 штамм образует белый воздушный мицелий и дает конидиальное спороношение типа Sphacelia.

Конидиеносцы палочковидные, простые, бесцветные, 11,2 — 14,4>»,3,2 р,. Конидии одноклеточные, бесцветные, элипсоидной формы 4,8 — 8 3,2 ц. При выращивании штамма Claviceps sp. ИБФМ-F-401 в качестве источника углерода могут быть использованы следующие углеводы и спирты: глюкоза, сахароза, арабиноза, фруктоза, сорбит, маннит, инозит, в качестве источника азота-аммиак, соли аммония, аспарагин, дрожжевой экстракт, Пример. Условия культивирования гриба Claviceps sp. ИБФМ-F-401.

Культуру Claviceps sp. ИБФМ-F-401 поддерживают в пробирках со скошенной агаризованной средой Тг. Выращивание осуществляют в течение 12 дней при 24 С. Полученную таким образом культуру высевают в колбы объемом 750 мл со 150 мл срсды следующего состава, r: глюкоза 100; лимонная кислота 10; КНгРО4 0,5; MgSO» . 7НгО 0,3; дрожжевой экстракт 0,1;

FeSO4 7НгО 0,007; ZnSO».7Í20 0,006; водопроводная вода до 1 л, значение рН среды доводят концентрированным аммиаком до 5,2. Колбы с засеянными средами помещают на качалку с 170 — 180 об/мин при

24 С на 6 суток. Полученную культуру используют для инокуляции колб еыкостью

750 мл, содержащих 150 мл среды состава, г: сахароза 300; лимонная кислота 15;

КНгРО» 0,5; MgSO» 7НгО 0,25; дрожжевой экстракт 0,1; KCI 0,12; FeSO» 7НгО 0,007, ZnSO4.7НгО 0,006; вода водопроводная до

1 л; значение рН среды доводят до 5,2 концентрированным аммиаком. Культивирование проводят на качалке при 24 С в течение 10 — 12 дней. Содержание алкалоидов в

1О

20 >30

40 культуральпой жидкости, определенное, пектрофотометрически, со "тавляст 1,22 г/л.

Выделение и очистка элиыоклавина.

3,3 л культуральной жидкости отфильтровывают через фильтровальную бумагу в вакууме. Нативный раствор подщелачивают концентрированным аммиаком до рН 7,5 и экстрагируют порциями по 1 л хлороформом 8 раз. Для ускорения разделения слоев используют центрифугирование на центрифуге К-70 (5000 об/мин, Т 20 мин). Контроль за полнотой экстрации осуществляют с помощью реактива Ван Урка. Объединенный хлороформный экстракт высушивают пад прокаленным МагЯО», упаривают в вакууме. Выход суммарной смеси алкалоидов

2,79 г (69% ) .

Для отделения элимоклавина суммарную смесь обрабатывают 100 мл кипящего метанола, охлаждают раствор и отфильтровывают осадок. В осадке по хроматографическиы и спектроскопическим данным — элиыоклавин (содер>канне основного вещества не менее 90%). Выход 1,74 г.

Дополнительно хроматографией после разделения маточника на окиси алюминия (V степень активности, элюепт †хлороформ), а затем на силикагеле (элюент—

СНСIЗ . СНэОН: конц. NH»OH=90: 10: 1) выделяют 250 мг элимоклавина.

Таким образом, культивирование гриба

Claviceps sp. ИБФМ-F-401 позволяет значительно сократить время проведения процесса (в 2 — 2,5 раза). Кроме того, гриб

Claviceps sp. ИБФМ-F-401 обладает относительной селективностью в отношении продуцирования элимоклавина. Содержание элпыоклавина в выделяемой смеси алкалоидов 70 — 75%. Это облегчает выделение и очистку целевого продукта.

Формула изобретения

1. Способ получения элимоклавина, предусматривающий глубинное культивированиенпе гриба-продуцента при аэрации на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли, выделсние и очистку целевого продукта, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью сокращения времени культивирования, в качестве продуцента используют штамм Claviceps sp.

ИБФМ-F-401.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что штамм Claviceps sp. ИБФМ-F-401 выращивают на питательной среде следующего состава, г/л:

Сахароза

Лимонная кислота

Дрожжевой экстракт

КНгРО»

MgSO4 7Н,О

ZnSO4 7НгО

FeSO4 7Н2О

735010

Составитель А. Мелентьева

Текред Л. Куклина

Редактор 3. Бородкина

Корректор О. Силуянова

Заказ 2512/5 Изд. Ма 643 Тираж 530 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 5К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

КС! 0,1 — 0,2

Водопроводная вода До 1 л рН среды доводят концентрированным аммиаком до 5,2.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование штамма Claviceps sp.

ИБФМ-F-401 ведут в течение 10 — 12 сут.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. А. Hofmann, R. Brunner, Н. КоЬе1, А. Brack new Alkaloide aus der saprophyti5 !!

schen Kultur des Multer kornpilzes von

Рennisetum typhoideum Rich Helvetica

Chimica Acta, 1957, 40, 7, 1358 — 1373.