Способ определения активности полиеновых антибиотиков

 

Союз Соеетскик

Социапнстическик

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

<» 741154 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 04.01.79 (21) 2739901/30-15 (51)M. Кл. с присоединением заявки №

G 01 N 33/16

Гооударстеенный комитет (23 } Приоритет ао делам изобретений и открытий

Опубликовано 15.06.80. Бюллетень ¹ 22

Дата опубликования описания 15.06.80 (53) УДК 615.779. .9: 576.8.095. .14 (088.8) (72) Авторы изобретения

А. М. Королев, Ю. Е. Конев, В. Г. Митрофанова и Г. Б. Туркевич

Всесоюзный научно-исследовательский технологический институт антибиотиков и ферментов медицинского назначения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПОЛИЕНОВЫХ

АНТИБИОТИКОВ

Изобретение относится к метптцинской нро мышленности и может быть использовано для определения активности полиеновых антибиотиков.

Известны способы определения активности полиеновых антибиотиков, например биологический способ, заключающийся в измерении величины зон угнетения роста тест-микроба на питательном агаре (1) .

Однако известный способ определения активности полиеновых антибиотиков является очень 10 трудоемким и не обладает быстротой определения: требуется не менее 18 ч для выявления зон угнетения роста тест-микроба, по которым судят об активности антибиотика, Наиболее близким к изобретению является способ определения активности антибиотиков по кинетике процесса их взаимодействия с дрожжами с помощью микрокалориметра.

Однако этот способ отличается малой чувст20 вительностью.

Целью изобретения является повышение чувствительности определения активности антибиотиков, 2

Для достижения укаэанной цели в качестве исходного одноклеточного организма используют хлореллу, а активность антибиотиков устанавливают по изменению величины интенсивности начальной вспышки послесвечения клеток хлореллы при их взаимодействии с антибиотиками.

Кроме того, для достижения указанной цели интенсивность начальной вспышки послесвечения измеряют в интервале 10 4 — 10 з с.

Пример 1. Определение активности образцов нистатина.

Хлореллу выращивали на среде Тамия > общепринятых условиях и сохраняли при +4 С.

Строили стандартную кривую зависимости начальной вспышки индукционной кривой послесвечения хлореллы от концентрации нистатина. Для этого стандарт нистатина растворяли в диметилформамиде 1 мг/мл и готовили ряд разведений из этого раствора 10, 10 з ...10 " в фосфатном буффере рН 7,0. Далее растворы нистатина в фосфатном буффере в количестве 0,5 мл вносили в 1 мл (3 10 клеток хлореллы-подсчет вели с помощью камеры Горяева) суспенэии клеток хлореллы в фосфатном буффере рН 7.0.

3 74

Одновременно готовили контроль — суспензию клеток хлореллы без внесенияполиеновогоентибиотика. Контрольные и опытные образцы выдерживали перед регистрацией послесвечения

5 мин при +20 С и освещении 10 эрг/cM с.

Затем исследуемый образец помещали в установку и экспонировали его в темноте 3 мин для получения индукционной кривой послесвечения. Индукционная кривая послесвечения клеток хлореллы характеризуется следующими параметрамизеличиной начальной вспышки послесвечения (А) и устанавливающимся значением интенсивности послесвечения (С) (фиг. 1) .

Величину начальной вспьппки контроля суспензии клеток хлореллы принимали за 100 o. По величине снижения начальной вспышки послесвечения опытного образца хлореллы определяли содержание в пробе нистатина, пользуясь стандартной кривой (фиг. 2).

Пример 2. Определение активности гептаенового неароматического антибиотика амфотерицина В.

Применяли установку и взвесь хлореллы, как в примере 1. Строили стандартную кривую зависимости начальной вспышки индукционной кривой послесвечения клеток хлореллы от концентрации стандарта-амфотерицина В (фиг. 3) .

Концентрацию амфотерицина В в опытных растворах определяли по снижению интенсивности послесвечения их смеси (1:2) с суспензией хлореллы в фосфатном буфере рН 7,0.

Пример 3. Определение активности лев орина.

Применяли установку и взвесь клеток хлореллы, как в примерах 1 и 2. Строили стандартную кривую и определяли содержание антибиотика в опьпных растворах, как в примерах 1 и 2 (фиг. 4).

В таблтще приведены сравнительные данные способов определения активности полиеновых антибиотиков.

1154

Антибиотик

Минимальная рация, мкг/мл

Биологический метод по угнетению роста тест-микроба"

18

0 05 — 0,08

0,04 — 0,06

Нистатин

Лев орин.

1О

Амфотерицин В

0,03 — 0,05

Метод послесвечения""

1/12

1/12

0,01 — 0,05

0,01 — 0,02

Нистатин

15 Леворин

Амфотерицин В

1/12

0,02 — 0,04 х

Трудоемкость высокая

Трудоемкость низкая

Предлагаемый способ обеспечивает быстрое и точное определение активности полиеновых антибиотиков с низкой трудоемкостью.

Формула изобретения

1. Способ определения активности полиеновых антибиотиков путем установления физико-химических характеристик взаимодействия антибиотиков с одноклеточными организмами, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве исходного одноклеточного организма используют хлореппу, a активность антибиотиков устанавливают по изменению величины интенсивности начальной вспышки послесвечения клеток хлореллы при их взаимодействии с антибиотиком.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что интенсивность начальной вспышки послесвечения измеряют в интервале 10 4 — 10 с.

Источники информации, 40 принятые во внимание при экспертизе

1. Гров Д. С., Рендалл В. А. Руководство по лабораторным методам исследования антибиотиков. Пер, с англ. М., Медгиз, 1958.

2, Bull. Brit, Мусо! Sac., 1977,.ч. 11, М 2.

741154

10 ур-6

Комцеитраци4, В р" 6

КОНцеитрация, г

ЦНИИПИ Заказ 3194(44

Тираж 1019 Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4