Способ получения конъюгированногос белком аминазина
Союз Советских
Социалистических
Рвспублик
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
<>800877
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт . сеид-ву— (22) Заявлено30.03 ° 79 (21) 2748079/28-13 с присоединением заявки т4о (23) Приоритет
Опубликовано 3001,81, Бюллетень Йо 4 51 М К„з
G 01 N 33/48 (осударствеииый комитет
СССР ио делам иэобретеиий и откр ыти и (53) УДК 578.8. .097 (088.8) Дата on убликоваиия описания 30 ° 01. 81 (72) Авторы изобретения
И . Е . Ковалев, О.Ю. Попевая и Л. A. Базарова ,.т у - Ф, Научно-исследовательский ик "титут по био)тогическим испытаниям химических соединений т . г (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГИРОВАННОГО С БЕЛКОМ
АМИНАЗИНА
Изобретение относится к иммуноло- гии и.может быть применено в медицине и биологии для получения антител к фенотиазиновым лекарственным препаратам, для изучения толерантности к аминазину, нейтрализации его токсического действия, а также для определения низких концентраций этих лекарств в биологических жидкостях- с помощью иммуно-химических методов.
Известен способ получения конъюгированного с белком аминазина путем проведения реакции комплексообразования реакционноспособного производного аминазина с белком (1f. !5
Однако известный способ позволяет получить аминазин, содержащий 9 моль производного аМиназина, ковалентно связанных с 1 моль белка, конверсия реакционноспособного производного 20 аминазина составляет 13% . Способ трудоемкий, используются дорогостоящие реактивы .
Цель изобретения — повьхаение содержания аминазина в конъюгате и упрощение способа.
Цель достигается тем, что в качестве реакционноспособного производного аминазина используют и-аминодиЪ фенил азоаминазин и реакцию комплексообразования ведут с бычьим сывороточным альбумином.
Пример 1. Получение и-амин одифенилазоаминазина.
К смеси 1,84 г (0,01 моль) бензидина, 2 мл (0,05 моль) муравьиной кислоты и 100 мп воды добавляют при
-10 С 1,518 г (0,022 моль) нитрита натрия в 2 мл воды . Реакционную смесь выдерживают при охлаждении и перемешивании в течение 1 ч. Полученный раствор прибавляют к раствору 3,55 r (0,01 моль) хлоргидрата аминазина в
20 мл воды, поддерживая рН 7-8 добавлением 10%-ного раствора гидроокиси натрия. Выпавший осадок отфильтровывают, трижды прсеывают водой, отфильтровывают, высушивают и перекристаллизовывают из слаеси хлороформ-петролейный эфир (1:1) . Получают 4 г п -аминодифенклазоаминазина. Выход
85%.Т .пл . выае 300 С, Rf 0,47 (пиридин-этилацетат-вода 1:1:1) ..В ИКспектре полученного соединения имеетт ся полоса поглощения в области 3430см, характерная для колебаний свободной аминогруппы. Найдено, В: с 84, 35;
Н 5,50 . Вычислено, Ъ: С 84,20; Й 5,55 .
800877
Формула изобретения!
Составитель С . Малютина
Редактор Н . Бушаева Техред С.Мигунова Корректор И. Муска
Заказ 0 0 59 . Тираж 918 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб ., д . 4/5
Филиал ППП Патент, r . Ужгород, ул . Проектнаяр
Получение конъюгированного антигена аминазин-бычий сывороточный альбумин .
К смеси 260 мг (0,5 моль) и-аминодифенилазоаминаэина и 10 мл концентрированной соляной кислоты при температуре -10 С добавляют 35 мг
0 5 (0,55 моль) нитрита натрия в 2 мл воды . Реакционную смесь выдерживают при охлаждении и перемешивании в течение
30 мин. Полученный раствор прибавляют при температуре 0-10 С к раствору
500 мг (0,072 ммоль ) бычьего сывороточного альбумина в 10 мл воды, поддерживая рН 7-9 добавлением 10%-ного раствора гидроокиси натрия . Смесь ос— тавляют на ночь при температуре 0-4 С.15
Полученный яркоокрашенный раствор конъюгированного антигена аминаэинбычий сывороточный альбумин очищают от ниэкомолекулярных примесей диалиэом против дистиллированной воды в Щ течение 6 сут . После удаления воды лиофильной сушкой получают 500 мг сухого порошкообразного целевого проду к.
Содержание ковалентно связанного аминазина в синтезированном конъюгированном антигене определяют спектрофотометрически по разнице введенного в реакцию и непрореагировавшего п-аминодифенилазоаминаэина по известному способу . Устанавливают удельное поглощение низкомолекулярной фракции, выделяемой после диализа из реакционной смеси. Для этого и-аминодифенилаэоаминазин обрабатывают в условиях, аналогичных условиям реакции З5 ковалентного связывания, но в отсутствии белка, и изучают УФ-спектр полученной смеси. Установлено, что поглощение ее в концентрации 1 мг/мл в пересчете на исходный и-аминодифе- 4О нилазоаминазин при 280.нм составляет
10,0. Количество и-аминодифенилазоаминазина (в мг), не вступившего в реакцию с белком рассчитывают по фор7
Ч Е
tO/O где V u EV - объем и поглощение при
280 нм низкомолекулярной фракции, выделенной после реакции.
По даиным спектрофотометрии рассчитывают, что иэ 260 мг производного аминазина в реакцию с белком вступило 80 мг. Таким образом, при укаэанном соотношении исходных компонентов получают конъюгированный антиген аминазин-бычий сывороточный альбумин, содержащий 21 остаток аминазина, ковалентно связанные с 1 моль белка.
Пример 2. По вышеописанной методике иэ 300 мг (0,58 моль) иаминодифенилазоаминазина и 3 r (0,045 моль) бычьего сывороточного альбумина получают конъюгированный антиген аминазин-бычий сывороточный альбумин, содержащий 9 моль производного аминазина, ковалентно связанных с 1 моль белка.
Применение предлагаемого способа позволяет повысить конверсию реакционноспособного производного аминазина в 6 раз, исключить из процесса целый ряд реактивов и растворителей, удешевить способ получения конъюгированных антигенов аминазин-белковый антигенный носитель .
Способ получения конъюгированного с белком аминазина путем проведения реакции комплексообраэования реакционноспособного производного аминазина с белком, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения содержания аминазина в конъюгате и упрощения способа, в качестве реакционноспособного производного аминазина используют п-аминодифенилазоаминазин и реакцию коплексообразования ведут с бычьим сывороточным альбумином.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. Патент CUA Р 3976763,кл .424-1,5, 24 .08 .76 .
