"способ получения агликона антибиотческого а-35512 фактора в4

 

Союз Советских

Социалистических

Республик ри833166

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту

Щ KJ1Ç (22) Заявлено 2704,78 (21) 2485600/

/2610502/30-15 (23) Приоритет 230577 (32) 24. 05. 76

С 12 К 1/00

Государственный комитет

СССР. ио делам изобретений и открытий (31) 689274 > 689273 (33) США

Опубликовано 23.05.81. Бюллетень ¹ 19 (53) УДК 577 152 (088. 8) Дата опубликования описания 230581 (72) Автор изобретения

Иностранцы

Карл Хайнц Михель и.Кэлвин.. Юджин (США) Иностранная фирма

fl Il

Эли Лилли энд Компани (США) (71) Заявитель ф »

Ф нормальной органической или минеральной кислотой в течение 0,5-12 ч.

Агликбн фактора А-35512 В получают путем ферментации в аэробных условиях культуры Streptomyces сап4idus NRRL

8156. Микроорганизмы выращйвают на среде с источником углеводов, азота, минеральных солей до получения достаточной антибиотической активности.

Смесь A-35512,содержащую факторы А, В, С, F, G . Й, отделяют от среды для культивирования. Далее извлекают фактор В и из него путем кислотного гидролиза выделяют агликон.

Дигидрохлорид А-35512 фактора В имеет, по крайней мере, одну гидроксильную группу, способную участвовать в эфиризации.

Дигидрохлорид А-35512 фактора В растворяется в воде, частично растворяется в спиртах, таких, как метанол и этанол, и нерастворим в других ме нее молярных органических растворителях, таких как бенэол,хлороформ, ацетон, диэтиловый эфир, этилацетат, толуол, гексан, ацетонитрил и диоксан.

Дигидрохлорид A-35512 фактора В стабилен в течение 72 ч в водных растИзобретение относится к .получению антибиотиков путем культивирования микроорганизмов и выделения целевого продукта из культуральной жидкости. Точнее, способ касается получения агликонового фактора смеси антибиотиков А-35512, образуемых микроорганизмами вида Streptomyces candidus

НКК1 8156, 10

Известны антибиотики A-35512, которые обладают свойствами, аналогичными свойствам гликопептидных соединений. Эти вещества достаточно хорошо изучены. Выделены различные Фракции с антибиотической активностью. Известны, например, ристомипины, pHcTDцетины. Для получения указанных антибиотиков используют различные способы — экстракция, хроматография, гидролиз (1) и (21.

Однако известные антибиотические вещества и способы их получения не касаются лечения кариеса зубов и угрей. 25

Цель изобретения — получение агликона A-35512.

Поставленная цель достигается тем, что фактор-В гидролиэуют 0,05-1,5 30 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АГЛИКОНА АНТИБИОТИЧЕСКОГО

А-35512 ФАКТОРА В

833166

PPM

Высота,Ъ

155,4

154,5

149,3

138,8

136,9

136, 3

135 2

134,7

56,7

50,5

43,0

38,8

54,3

40,2

31,7

28,4

40,9

102,9

21

22

77,2

57,5

38,1

44,4

31,5

31,0

28

47,9

81,2

31

32

33

34

36

37

38

39

41

42

43

44

26,5

33,4

39,8

33,9

40,2

43,1

33 6

5 7,, 8

3 3, 1

3 0, 1

3 6, 0

4 3, 4

6 0, 9

4 3, 9

55,7

47,8

43,7

2

5 б

187,8

172,0

170,7

170,1

169,6

168,4

166,7

157,4

156,6

155, 7

155,6

37,2

40,9

45,2

46,9

47,7

-0И80 — 46

A С спектр ЯМР указывает на то, 1Э что A-35512 фактор В агликон продолжа.ет удерживать составляющие 3-амино-2,3,6-тридиокси-З-C-метил-L-ксилогексапиранозу (один из сахаров, содержащихся в A-35512 факторе В).

57,6

52,5

49,9

45 5

55,8

71,5

8.

9 10

11 да ворах, имеющих рН в области от 3 до 10.

Гидрохлорид A-35512 фактор В агликона является белым аморфным соединением, имеющим следующий состав, В: углерод 54;29; водород 4,34; азот

7,40; хлор 5,02; кислород 28,95.

Инфракрасный спектр поглощения гидрохлорида A-35512 фактор В агликона в пасте Нуйола имеет наиболее значительные пики поглощения на следующих частотах,см : 3440 (изгиб), 3340 (изгиб), 3215 (интенсивный), 2950 (изгиб), 2910 (интенсивный), 2840 .(интенсивный),2640 (изгиб), 1735.(слабый), 1655 (интенсивный), 1590 (умеренный), 1500 (интенсивный), 1460 (интенсивный), 1378 (умеренный), 1365 (изгиб), 1298 (умеренный), 1215 (умеренный), 1155 (умеренный), 1120 (изгиб), 1105 (слабый), 1060 (слабый),1040 (слабый), 1008 20 (умеренный), 925 (слабый), 875 (слабый), 765 (изгиб) и 718 (слабый).

Злектрометрическое титрование гидрохлорида A-35512 фактор В агли кона в 66%-ном водном растворе ди- р метилформамида указывает на присутствие трех титруемых групп с значениями рКц, равными 7,5; 9,25 и 11,0, и на возможное присутствие двух дополнительных групп со значениями рН большими чем 11,0.

Гидрохлорид A-35512 фактор В агликона имеет мол. вес около 1282, что установлено при помощи титроваиия.

Гидрохлорид A-35512 фактор В агликона имеет следующие характерные вращения: с, — 178 (С 5, СН. 0H); об

365-716,8 (С 5, СКЛОН).

Ультрафиолетовый спектр поглощения. агликона имеет в кислом и нейтральном метаноле максимум поглощения в 40

282 нм (Е„" 102,62), а в щелочном метаноле — максимум поглощения в

302 нм (Е,, 182,09).

А С сйектр ядерного магнитного резонанса A-35512 фактор В агликона 45 в ЬН50-д при 90 С имеет следующие характеристики:

Р РРМ . Высота, Ъ

133,8 .128, 2

126,2

123,0

121,3

117,7

117,0

108,6

106,7

105,7

103,2

93,6

74,9

71,8

68,9

63,2

60,4

57 1

55,2

53,2

51,8

40,7

39,9

39,1

23,8

17,1

0,0

Амико-кислотный анализ гидрохлориА-35512 фактор В агликона, поп833166

40 вергнутого дальнейшему гидролиэу в кислоте, указывает на то., что A-35512 фактор В агликон содержит глицин и, по крайней мере, три составных аминокислотных остатка.

Гидрохлорид A-35512 фактор В агликона имеет., по крайней мере, одну гидроксильную группу, способную участвовать в процессе этерификации.

Гидрохлорид А-35512 фактор В агликона растворим в воде и метаноле, но не растворим в менее полярных органических растворителях, таких как бензол, хлороформ, ацетон, диэтиловый а эфир, этилацетат, толуол, гексан, ацетонитрил и диоксан.

Гидрохлорид A-35512 фактор В агли- кона в системе бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода (15:10:3:12) имеет R@ равное 0,80, полученное при помощи тонкослойной хроматографии на целлюлозе с алюминиевым носителем. 20

Гидрохлорид А-35512 фактор В агликона имеет R равное 0,26, которое получено при. помощи тонкослойной хроматографии на силикагеле с использованием в качестве растворителя смеси метанол-хлороформ-концентрированная гидроокись аммония (3:2:1),, A-35512 фактор А агликон (свободное основание) является белым аморфным соединением, имеющим элементарный состав (усредненный),Ъ: углерод

52,65; водород 4,57; азот 6,91; хлор

2,94; кислород 27,04; кальцинирован- ная сода 4,70.

Инфракрасный спектр поглощения

А-35512 Фактор В агликона. (свободное основание) в таблетке из KBr имеет значительные пики поглощения на следующих частотах,.см ": 3360 (интенсивный), 3260 (изгиб), 2940 (изгиб), 1735 (изгиб),1660 (интенсивный), 40

1598 (умеренный), 1510 (интенсивный), 1440 (умеренный), 1295 (слабый), 1215 (умеренный), 1165 (умеренный), 1122 (слабый), 1070 (слабый), 1018 (интенсивный), 940 (слабый) и 920 45 (слабый).

Электрометрическое титрование

А-35512 фактор В агликона (свободное основание) в 66%-ном водном растворе диметилформамида.указывает на при- О сутствие пяти титруемых групп с значениями рК, приблизительно равными 6,2; 8,2; 10,1; 11,4; 12,4, и на возможное присутствие одной или двух дополнительных групп с значениями IKà превышающими 12,5 °

A-35512 фактор В агликон (свободное основание) имеет следующее ха-. а рактерное вращение: d D -64,5 (Сз, DMSO), Ультрафиолетовый спектр поглоще" ния А-35512 фактор В агликона (свободное основание) показывает в нейтральном и кислоы метаноле. максимум поглощения в 282 нм (E< 43,65) и

t в щелочном метаноле - максимум поглощения в 301 нм (Е„„ 67,46), Значения R äëÿ A-35512 фактор В агликона (свободное основание) совпадают со значениями гидрохлорида .

А-35512 фактор В агликона.

Пример, Таблетку лиофилиэированного Streptomyces cendldus

NRR78256 растворяют в 1-2 мл стерильной воды. Далее этот раствор используется для прививки культуры на наклонном агаре и 2, содержащем экстракт солода дрожжей Бакто LSP (лаборатории 0ifco Детройт,. Мичиган), Привитый агар в течение семи дней выращивают при температуре 30 С. Со" зревшую на агаре культуру покрывают водой (2 мл) и соскабливают при помощи стерильной пипетки, с тем, чтобы разрыхлить споры. Порция (0,1 мл) этой водной суспензии, содержащей споры, используется для прививки другого косого агара LSP 9 2. Этот привитый агар выращивают в течение семи дней при 30 С. Созревшую на агаре культуру покрывают водой (5 мл) и соскабливают при помощи стерильной пипетки с тем, чтобы разрыхлить споры.

Порция (2,5 мл) полученной суспензии спор используется в качестве прививочного материала для прививки 50 мл вегетативной среды, для выращивания культуры, имеющей следующий состав: соевый бульон Frypticese (биологические лаборатории в.Балтиморе, Ко" кисвилл, Мериленд) 30 г, вода (деионизированная) 1 л.

Привитую среду для выращивания культуры инкубируют при 30 С в течение 48 ч в 250-миллиметровой колбе

Эрленмайера, находящейся на вибраторе, имеющем скорость вращения

250 об/мин.

Выращенный инокулят (0,5 мл) используют для повеса 50.мл среды следующего состава, г/л:

Декстрин тапиоки 25,0

Глюкоза 1а,а

НН4МОЗ 2,5

КСЕ 1,5

HgS04 1,1

FeC 3 -4Н О 0,3

ZnC 5 0,3 кн ро,. 1,0

L-Глютаминовая кислота 0,1

DL-Цитруллин, Oil

Са СО.ь 5,0 .Деионизированная вода 1 л

Привитую среду инкубируют при

32 С в течение 8-10 дней в колбе

Эрленмайера объемом 250 мл на упомянутом вибраторе.

Ферментацию проводят на среде для выращивания культуры, имеющей следующий состав, г/л: декстрин тапиоки 75,0; меласса 40,0; растворимый мяс833166 ной пептон 15,0; t104 7Н 0 0,5; СаСС1>

2,0; Н20 1 л.

Отделение A-35512 антибиотической смеси °

Культуральную жидкость с продукта.ми ферментации фильтруют с использованием ускорителя фильтрования (Hyflo

Super-cell диатомовая земля, фирма

Джон-Мэнвилл Продактс), при этом рН

6,8-7,2. Полученный таким образом прозрачный фильтрат пропускают через колонну, содержащую 10 мл полимерного адсорбента (Amberlete XA0-4, фирма Ром и Хаас) на 100 мл фильтрата, со скоростью 150 мп/мин. Полученные таким. образом фракции исследуют на биологическую активность против

Sarciпа 1utea с использованием известного способа отбора проб на диски.

Биологически неактивный эффлюент отбрасывают. Затем колонну промывают водой (1/8 от объема культуральной 0 жидкости) со скоростью 150 мл/мин.

Неактивная промывочная вода отбрасывается.

Затем колонну элюируют 50Ъ-ным водным раствором метанола (600 л) g5 со скоростью 200 мл/мин. Элеат, содержащий A-35512 антибиотическую смесь, концентрируют под вакуумом до объема в 15 л, в котором содержится около 200 r A-35512 антибиотической смеси на литр.

Разделение различных факторов в

А-35512 антибиотической смеси.

A-35512 антибиотическая смесь (около 3000 г, растворенных в 15 л метанола), полученная как описано выше, подвергается хроматографии на полиамидной колонне (Воэльм, 100 л), Затем колонна элюируется при помощи. деионизированной воды со скоростью около 80-120 мл/мин.

Фракции исследуют с использованием целлюлозной тонкослойной хроматографии или бумажной хроматографии, а в качестве растворителя используют смесь, и-бутанол-пиридин-уксусная 4 кислота-вода (15:10:3:12), кроме то.го, осуществляется биоавтография для

Sarcine lutea.

Первые 100 л элюата отбрасывают.

Затем скорость потока изменяют до

160-200 мл/мин при этом осуществляют отбор фракций, объемом 12 л.

Этим способом отбирают двадцать

12-литровых объемов.

B этот момент меняют элюирующий растворитель, вернее, процентный состав его ингредиентов1при этом осуществляют следующие операции: содержимое контейнера (360 л метанола) сифонируют в контейнер, содержащий 120 л воды; В контейнере для во- 60 ды смешанный раствор перемешивают. и направляют в колонну. После этого прОизводят сбор двадцатИ четырех объемов (в 24 л каждый) при скорости потока 200-300 мл/мин.

На основе результатов биоавтографии, группы объемов соединяют и выпаривают до сухости под вакуумом, в результате этого получается дигидрохлорид А-35512 фактора В и. следующая обогащенная смесь факторов:

Объемы Объем, л Фактор (S) Bec, r

1-10 120 А + Н 192

11-24 216 В 269

25-31 168 В + С 590

32-44 312 С, Е, F, G 224

Очистка А-35512 фактора В.

Частично очищенный дигидрохлорид

A-35512 фактора В (400 r), растворяют. в 1,2 л 50Ъ-ного водного раствора метанола и производят хроматографии на колонне, содержащей окись алюминии, которая приготавливается следующим образом: кислотообразующий окисел алюминия (100 кг, M.Boýëüì) перемешивают в 50Ъ-ном водном растворе метанола. После того, как смесь отстоится, образующийся сверху раствор сливают и удаляют. Окись алюминия снова перемешивают с 50Ъ-ным водным раствором метанола, а затем помещают в колонну, имеющую диаметр

13,5 см. Теперь колонна., содержащая окись алюминия, промывается водным раствором метанола (50Ъ-ным) до тех пор, пока не появится прозрачный эффлюент. Колонна элюируется 50о-ным водным раствором метанола со с«оростью около 8-10 мл/мин, при этом осуществляют сбор фракций объемом около 240-300 мл. Фракции исследуют при помощи тонкослойной хроматографии. На основании этих данных фракции соединяют, при этом виход очищенного дигидрохлорида А-35512 фактора

В в зависимости от номера фракции распределяется следующим образом: фракции. 17-21 — 9,6 г; фракции 2229 - 72,0 г; фракции 30-37 — 117,0 г.

Каждая из них кристаллизуется из концентрированного 50Ъ-ного водного раствора метанола при 4 С. Очищенный таким образом дигидрохлорид

A-35512 фактора В содержит около

4,6Ъ хлора. Раствор дигидрохлорида

А-35512 фактора В в 66Ъ-ном водном растворе диметилформамида имеет рН 6,5.

Получение А-35512 агликона.

Дигидрохлорид А-35512 фактора В (5,0 г) растворяют в воде (200 мл).

Этот раствор подкисляется при помощи

4Н раствора соляной кислоты (14 мл), Полученный в результате раствор подвергают дефлегмированию в течение

2 ч. Затем раствор охлаждают и выпаривают под вакуумом до объема, составляющего 3/4 первоначального объема.

Затем в полученный раствор покапельно добавляют соляную кислоту (6Н) до тех пор, пока не закойчится образование осадка. Полученный в результате

833166

Формула изобретения

Составитель М. Мирзаев

Редактор Г. Волкова ТехредЖ. Кастелевич КорректорС. Шекмэр

Заказ 4091/88 Тираж 528 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r Ужгород, ул. Проектная, 4 осадок отделяют и сушат, в результате получается 3,56 г неочищенного гидрохлорида A-35512 агликона.

Неочищенный A-35512 агликон очищают при помощи хроматографии на окиси алюминия, промытой кислотой с использованием в качестве растворИтеля раствор вода-метанол (1:9).

Элюирование колонны сопровождается анализом при помощи целлюлозной тонкослойной хроматографии. Элюирован ные фракции, содержащие A-35512 агликон, смешивают и выпаривают под вакуумом, в результате получается

398 мг частично очна(енного продукта.

Сравнение результатов тонкослойной хроматографии с исполвзованием для анализа струи нингидрина, показывает, что примеси не являются биоактивными.

Порция этого частично очищенного

A-35512 агликона (100 мг) проходит 20 дальнейшую очистку при помощи хроматографии над полиамидом (4 r, фирма

Машери, Нагель и Ко, МИ-5С-6), (фирма Бринкман Инструмент, (0,07 мм) и элюируют водой. Эта колонна также подвергается анализу при помощи целлюлозной тонкослойной хроматографии, как это было описано выше.

Элюированные фракции, содержащие

A-35512 фактор В агликон, смешивают и лиофилизируют, в результате получается 64 мг очищенного гидрохлорида A-35512 фактор агликона.

Общий выход составляет 5,08% от исходного А-35512 фактора В, Получение А-35512 фактор В агликона в форме свободного основания.

Гидрохлорид А-35512 фактор В агликона (90 мг) растворяют в 30 мл смеси метанол-вода (1:1). Этот раствор нейтрализуют при помощи ионо-обменной смолы (3,5 мл BiO-Rod AG-34Х(ОН /). Полученный в результате раствор перемешивают в течение

15 мин при комнатной температуре.

Затем смолу удаляют при помощи фильтрации. Фильтрат концентрируют под вакуумом, при этом поддерживают температуру менее 60"С до объема, составляющего половину первоначального, затем лиофилизируют, в результате получается 68 мг A-35512 фактор В агликона в форме свободного основания.

Предлагаемый способ позволяет получать вещество, обладающее антибиотической активностью против возбудителей кариеса зубов и лечебным эффектом от прыщей.

Способ получения агликона антибиотического A-35512 .Фактора В, включающий выращивание организмов

B a Streptomyces cand1dus ИКВЕ8156 или их мутантов, вырабатывающих антибиотическую смесь А-35512, отделение смеси А-35512, выделение A-35512 фактора В, о т л и ч а ю щ.и и с я тем, что, с целью получения агликона

A-35512, фактор В гидролизуют 0,051,5 нормальной органической или минеральной кислотой в течение 0 5-12ч.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Бражникова М.Г. и др. Ристомицин и его применение в клинике. М., "Медицина", 1965, с.21-23.

2. Блинов Н. О. и Хохлов А. С.

Бумажная хроматография антибиотиков.

"Наука"„ 1970, с.252-253 (прототип).