Способ определения патогенностинейссерий

 

(72) Авторы изобретения

О.П. Галеева, Г. И. Рузаль и N.Â. Ермолаева,, 1 !

Казанский научно-исследовательский инсти емколог ии— и микробиологии (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННОСТИ НЕЙССЕРИЙ

Изобретение относится к медицинской микробиологии.

Известен способ определения пато генности нейссерий путем заражения куринных эмбрионов с последующим инкубированием и определением жизнеспособности эмбриона . 11.

Однако известный способ недоста-. точно чувствителен.

Цель изобретения — повышение чувствительности способа., Эта цель достигается тем, что определяют патогенность нейссерий путем заражения куриных эмбрионов с последующим инкубированием и опре.делением жизнеспособности эмбриона, 15 при этом эмбрион заражают- 2 млрд. микробной взвеси нейссерий по 0,1 мл на хорионаллантоисную оболочку и после инкубирования дополнительно

20 определяют выракенность кровоизлияний,,отек мозга и других органов, парезов конечностей, по которым характеризуют степень патогенности. 2

Способ осуществляют следующим образом.

Подготавливают куриные эмбрионы, дЛя заражения берут 9-11-дневные куриные эмбрионы, у которых искусственно перемещают воздушный мешок для заражения через щель в скорлупе на хорионаллантоисную оболочку (ХАО).

Подготовка культуры нейссерий:

i6-20 часовую культуру нейссерий с сывороточного агара смывают физиологическим раствором (рН 7,0-7,2) и готовят 2 млрд. микробную взвесь, соответствующую 20 ед. международного оптического стандарта мутности.

Для заражения куриных эмбрионов

2 млрд. взвесь нейссерии вводят на

ХАО в объеме 0,1 мл таким образом, чтобы доза для одного эмбриона составила 200,млн. микробных тел. Это оптимальная доза инокулята, вызывающая различные степени тяжести пато- . логоанатомических изменений органов и тканей эмбрионов в зависимости о

834122

3 вирулентных свойств испытываемого штамма. Контрольной группе эмбрионов вводят по 0,1 мл стерильного фиэиоло. гического раствора. Опытные и контрольные группы эмбрионов инкубируют

20-24 ч в условиях периодически вен. тилируемой камеры термостата при

37-38 С.

Овоскопию проводят по общепринятой методике для определения жизнеспособ- 1О ности эмбрионов.

Определяют степень вирулентности исследуемого штамма нейссерий.

Яйцо вскрывают с соблюдением правил асептики, определяют жизнеспособность эмбриона по его подвижности и сравнивают с результатами овоскопии.

Затем стерильным шприцем отсасывают ликвор и кровь эмбриона для посева на сывороточный агар и приготовления маэ- о ков для повышения достоверности диагностики. После этого вскрывают брюшную и грудную полости, отсепаровывают кожу на голове эмбриона для обнажения мягкой мозговой оболочки. 25

Учитывают патологоанатомическую картину изменения органов и тканей: наличие тромбоза сосудов ХАО, кожных и мозговых кровоизлияний, спастически сокращенных мышц конечностей, отек 50 головного мозга, гиперемию и отек печени и почек.

Лля подтверждения специфичности развивающегося процесса, кроме BbIGBBQB 5 из ликвора и крови, можно сделать высевы из мозга, печени, сердца и почек.

Степени вирулентности исследуемого штамма нейссерии определяют при сравнении патологоанатомических изменений органов и тканей опытных и контрольных эмбрионов.

При вскрытии контрольные эмбрионы живые, с хорошо развитыми сосудами

ХАО; кожные покровы и внутренние ор 45 ганы без особенностей.

При вскрытии опытных эмбрионов, зараженных нейссериями, вявляется одна из четырех форм (степеней)изменений5О органов и тканей в зависимости от степ пени выраженности признаков — бессимптомная", "легкая", "средняя" и тяжелая

"Бессимптомная" форма. Опытные эмбрионы по внешнему виду и состоянию органов не отличаются от контрольных эмбрионов, хотя в высевах типируются нейссерии.

Д

"Легкая" форма. При вскрытии — живой эмбрион, сосуды ХАО без изменений, кожа светлая с единичными мелкоточечными кровоизлияниями, внутренние органы без изменений, однако на оболочках мозга единичные кровоизлияния.

"Средняя" форма. При вскрытии— погибший эмбрион с тромбированными сосудами и капиллярами ХАО;.на фоне гиперемированной кожи видна разнокалиберная сыпь, отмечается отек головного мозга, определяемый по выбуханию полушарий мозга и вытеканию красновато-желтой мутной жидкости при прокалывании кожи и оболочек мозга бактериологической петлей, инъекция капилляров и кровоизлияния на оболочках мозга. Выраженные изменения паренхиматозных органов, резкое увеличение в размерах, отек, гиперемия печени и почек. Сердце останавливается в систоле желудочков, предсердия заполнены темной кровью, просвечивающей через ткани сердца.

"Тяжелая" форма. Погибший эмбрион резко отличается от контрольных как по размерам, так и по внешнему виду.

Увеличение размеров эмбриона связано с резким отеком тканей, головного мозга и внутренних органов. Кожа резко гиперемирована с цианотичным оттенком, кроме типичной сыпи отмечаются кровоизлияния по ходу крупных сосудов на шее и лапах. Типичные спастические сокращения конечностей (поджатые лапы со сведенными пальцами, не поддающимися разгибанию).

Высоковирулентными счтают штаммы, дающие гибель эмбрионов с развитием

"тяжелой" степени поражений органов и тканей.

Умеренновирулентными — штаммы нейссерий, .вызывающие гибель эмбрионов и

"среднюю" степень их поражения.

Слабовирулентными — штаммы, вызывающие "слабую" степень поражения эмбрионов.

Авирулентными — штаммы, которые по результатам вскрытия, не зависимо от высева возбудителя и обнаружения его в мазках, не отличаются от контрольной группы эмбрионов.

Пример оценки степени патогенности нейссерий на куриных эмбрионах при заражении эталонными штаммами.

65, 4$

Заключение; штамм авирулентный.

Штамм й. flaba 65. Овоскопия(: один эмбрион погиб, остальные живые.

Вскрытие эмбрионов:, а) живые эмбрионы по внешнему виду

50 и состоянию органов не отличаются от контрольных эмбрионов, в высевах из тканей и жидкостей N.flaba. б) погибший плод — кожа светлая, . негиперемированиая, внутренние органы без особенностей, отсутствуют характерные признаки, наблюдаемые при заражении эмбрионов менингококковой культурой, такие, как полиморфные по

5 8341

Непатогенный штамм нейссерий N.Subflaba 20 М, Непатогенный штамм нейссерий N.flàbà

Слабовирулентный

5 штамм менингококка; M 20.

Высоковирулентный штамм менингококка . У 1298.

Штамм менингококка: У 1409/131.

16-20 часовые культуры вышеперечисленных штаммов нейссерий смывают физиологическим раствором с сывороточного агара и готовят 2 млрд. взвесь (20 Ед. по международному оптическому стандарту) и в объеме 0 1 мл вво- 1з дят на ХАО 9-11-дневным куриным эмбрионам..Контрольным эмбрионам аналогичным методом вводят фйзиологический раствор. Через 24 часа инкубации при

37-38 С в термостате яйца овоскопи-. 2р о руют и вскрывают. Сравнивают жизнеспособность эмбрионов, установленную при вскрытии яйца, с результатами овоскопии, делают высевы крови, ликвора, органов и мазки из ликвора, крови, 25 затем изучают степень патологоанатомических изменений органов и тканей эмбрионов.

Результаты опытов. Контрольная группа эмбрионов. 30

При вскрытии все эмбрионы живые с хорошо развитыми сосудами и капиллярами ХАО, которые заполнены светлой (артериальной) или(темной) венозной кровью. Кожные покровы и внутренние 3S органы без особенностей.

Штамм Й.Subflaba 20 М. Овоскопия: все эмбрионы живые.

Вскрытие эмбрионов: по внешнему виду и состоянию органов и тканей они 4Е не отличаются от контрольной группы эмбрионов. В высевах из крови, ликвора, внутренних органов и с оболочек мозга — N. Subflaba.

22 6

)техии, кровоизлияния по ходу крупных сосудов, отек головного мозга, резкая гиперемия и отек паренхиматозных органов. Таким образом, у одного эмбриона неспецифическая гибель, а остальные не отличаются от контрольных эмбрионов. Заключение: штамм вирулентный.

Штамм менингококка М-20. Овоскопия: все эмбрионы живые.

Вскрытие эмбрионов: живые эмбрионы, сосуды ХАО без изменений, кожа светлая с единичными мелкоточечными кро-. воизлияниями, внутренние органы без особенностей,,однако на оболочках мозга единичные кровоизлияния. Посевы крови стерильны, а в мазках крови и ликвора обнаружены менингококки.

Иэ посевов мозга, печени, почек, серд ца на сывороточный агар выделеныменингококки. Таким образом, у эмбрионов "легкая" степень поражения органов.Заключение: штамм слабовирулентный.

Свежевыделенный штамм менингококка У 1409/131.

Овоскопия: жизнеспособность нескольких эмбрионов четко определить не удалось.

Вскрытие эмбрионов: погибшие эмбрионы с тромбированными сосудами и капиллярами ХАО, на фоне гиперемированной кожи видна разнокалиберная сыпь, отмечается отек головного мозга, определяемый по выбуханию полушарий мозга и вытеканию красноватожелтой мутной жидкости при прокалывании кожи и оболочек мозга бактериологической петлей, инъекция капилляров и кровоизлияния на оболочках мозга.

Выраженные изменения паренхиматозных органов: резкое увеличение в размерах, отек, гиперемия печени и почек.Сердце останавливается в систоле желудочков, предсердия заполнены темной кровью, просвечивающей через гкани сердца. Таким образом, у эмбрирнов "средняя" степень поражения органов и тканей. Заключение: штамм

,;умеренновирулентный.

Штамм менингококка, В 1298. Овоскопия: все эмбрионы погибли.

Вскрытие эмбрионов: погибшие эмбрионы резко отличаются от контрольных как по размерам, так и по внешнему виду. Увеличение размеров эмбрионов связано .с резким отеком- тканей, головного мозга и внутренних органов. Кожа резко гиперемирована с цианотичным

83412 оттенком, кроме типичной сыпи отмечаются кровоизлияния по ходу крупных сосудов на шее и лапах. Типичны спастические сокращения конечностей (поджатые лапы со сведенными пальцами ), 5 неподдающиеся разгибанию. Поражение эмбрконов "тяжелой" степени. ЗаключеНИе1 высоковирулентный штамм.

Вышеизложенным способом удалось установить степень патогенности 39 свежевыделенных штаммов менингокок-.:ков к уточнить ее у 55 эталонных штаммов нейссерий, из них 30 штаммов ме" нигококков и 25 штаммов непатогенных видов нейссерий.

Предложенный способ позволяет повысить чувствительность и специфичность по сравнению с известным способом, так KcLK позволяет установить жизнеспособность эмбрионов. Кроме того, он в !О раз экономичнее, поскольку для заражения эмбрионов используют одну дозу вместо десяти.

Формула изобретения

Способ определения патогенности нейссерий путем заражения куриных эмбрионов с последующим инкубированием и определением жизнеспособности эмбриона, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, эмбрион заражают 2 млрд. микробной взвеси нейссерий по 0,1 мл на хорионаллантоисную оболочку и после инкубирования дополнительно определяют выраженность кровоизлияний, отек мозга и других органов, парезов конечностей, по которым характеризуют степень патогенности.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Касацкая Л.К. 0 токсичности и вирулентности менингококковых культур.

Канд. дисс. 1975, с. 143, Составитель С. Малютина

Редактор Е.Лушникова Техред А.Бабине Кор ектор Г. Решетник

Заказ 4128/47 Тираж 528 Подписное. ВНИИПИ Государственного комитета СССР . по делам изобретений и открытий

1-13035 Москва Ж-35 Раушская наб. . 4/5

Филиал ППП "Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4