Способ количественного определения нукле-озид-5 - монофосфатов

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ ИТИЛЬСТВУ

<((> 834512

j©( (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 31.1079 (21) 2834315/26-04 с присоединением заявки Н4 (23) Приоритет

Опубликовано 300581, Бюллетень М9 20

Дата опубликования описания 30.05.81 (51)М. Кл 3

6 01 и 31/16

Государствеииый комитет

СССР

fIo яелам изобретеиий и открытий (3) НЖ 543. 242. . 3 (088. 8) (72) Авторы изобретения

В.Я. Захаранс и И.У. Липсбергс (71) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

НУКЛЕОЗИД-5 -МОНОФОСФАТОВ

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам количественного определения нуклеоэнд-5" -монофосфатов, которые имеют большое значение в медицине, биохимии и молекулярной биологии.

Известен способ количественного определения нуклеозид- 5 -монофосфа( тов, основанный на способности оснований нуклеиновых кислот поглощать ультрафиолетовые лучи в области 240290 нм (11.

Недостатком этого способа является низкая .избирательность, поскольку невозможно определять нуклеоэид- 15

-5 -монофосфаты в присутствии деэокси-! рибонуклеозид-5-монофосфатов и нуклеозид-2(3)-монофосфатов.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемо- 20 му результату является сПособ количественного определения нуклеозид-5 -монофосфатов, заключающийся в последовательной обработке анализируемой пробы раствором периодата нат- 25 рия, раствором молибдата натрия при рН среды 2,9-3,1, раствором иодида калия с последующим титрованием полученного раствора тиосульфатом натрия в присутствии крахмала (2g . 30

Недостатком этого способа является низкая чувствительность определения, т.е. для проведения анализа требуется 35-40 мг анализируемого вещества.

Цель изобретения — повышение чувствительности определения.

Поставленная цель достигается тем, что в способе количественного определения нуклеоэид-5(-монофосфатов, заключающимся в обработке анализируемой пробы раствором периодата натрия, раствором молибдата натрия при рН среды 2,9-3,1 и раствором иодида калия с последующим титрованием полученного раствора тиосульфатом натрия в присутствии крахмала, полученный пос-. ле обработки анализируемой пробы периодатом натрия нуклеоэид-5 -моноI фосфатдиальдегид обрабатывают метиламином или бутиламином при рН среды

6,5-7,5 и температуре 35-40 С при мольном соотношении нуклеоэид-5 -монофосфатдиальдегид г периодат натрия : метиламин или бутиламин, pasном 1г10-15т160-800 соответственно.

В присутствии первичных алифатических аминов положительный эффект достигается тем, что в результате расщепления нуклеоэид-5 -монофосфат834512 диальдегидов,образуются три дополнительных моль иодата, которые действием избытка иодида калия переводятсн в эквивалентное количество иода. В конечном определении это приводит к измерению 24 эквивалентов титранта на 1 моль определения вместо 6 эквивалентов в известном способе, что представляет собой повышение чувствительности и экономии анализируемого вещества в 4 раза. Для проведения анализа по предлагаемому способу необходимо 7-10 мг анализируемого вещества.

Расщепление периодатом в присутствии первичных алифатических аминов протекает следующим образом.

Сперва нуклеозид-5" -монофосфатдиальдегиды реагируют с 1 моль первичного алифатического амина с образованием моноальдимина, который претерпевает внутримолекулярную конден- 20 сацию с образованием энамина. Последний образует четвертичное амониевое основание, которое быстро отщепляет фосфат, а после этого гидратация четвертичного аммониевого осно- 25 вания приводит к образованию другого энамина, который образует циклический эфир с периодатом. Гидролиз этого эфира приводит к образованию диола, который реагирует со вторым молем периодата с образованием карбоната гетероциклического основания, который при гидролизе образует промежуточный диол, реагирующий с третьим молем периодата.

Положительный эффект. заключается в повышении чувствительности способа в 4 раза, по сравнению с известным, вследствие образования 4 моль иодата в процессе окисления 1 моль нуклеозид-5"-монофосфата. 40

Температура среды 35-40 С обеспечивает- быстрое и количественное протекание. реакции расщепления нуклеозид-5-монофосфатдиальдегидов.При более низких значениях темпеРатуРы скорость 45 реакции расщепления замедляется— реакция протекает количественно лишь за 4-5.ч. При более высоких температурах заметно возрастает величина поправки расхода титранта в холостом опыте, что нежелательно при осуществлении аналитических определений.

Увеличение значения РН также ускоряет реакцию расщепления нуклеозид ,-5 -монофосфатдиальдегидов периода- том. Оптимален интервал РН 6,5-7,5.

:Повышение кислотности среды замедляет скорость этой реакции, а понижение кислотности среды выше РН 7,5 приводит к заметному возрастанию величины поправки расхода титранта в Щ холостом. опыте..

Соотношения нуклеозид-5 -монофос1 фатдиальдегид, периодат : первич ный алифатический амин 1 : 10

15 : 160 — 800 обеспечивают быстрое и количественное протекание реакции расщепления нуклеозид-5 -монофосфатI диальдегидов. При более низких концентрациях периодата и первичного алифатического амина по существующей методике проведение эксперимента невозможно.

Таким образом, предлагаемый способ заключается в следующем. !

Навеску определеяемого нуклеозид-5 -монофосфата, величиной.приолизительно 25 мкмоль, растворяют в дистиллированной воде и окисляют 1015-кратным молярным избытком периодата натрия. Затем в реакционную смесь вводят 160-800-кратное молярное количество первичного алифатического амина, нейтрализованное до РН 6,57,5 и выдерживают в водяной бане при 35-40 С в течение 1-2 ч. По окончании реакции расщепления создают

РН 3,0+0,2, замаскируют избыток периодата, а образовавшийся иодат избытком иодида калия превращают в эквивалентное количество иода, которое находят титрованием стандартным раствором тиосульфата натрия. Параллельно проводят холостой опыт (без навески нуклеозид-5 -монофосфата) .

Содержание основного вещества нуклеозид-5 -монофосфатов вычисляют

I по формуле (Н„- V) ° Н ° и

6 ° n ° g где Н, — объем стандартного раствора тиосульфата натрия, израс-. ходованный на титрование в . анализе, мл;

Н вЂ” объем стандартного раствора

2 тиосульфата натрия, израсходованный на титрование в холостом опыте, мл; и — нормальность стандартного раствора тиосульфата натрия (обычно 0,0250 н,), г-экв/ ;

M — молекулярная масса определя.емого нуклеозид-5 -монофосфата; д — навеска определяемого вещества, мг, n — число моль периодата, реагирующих с 1 моль нуклеозид, -5 -монофосфата (n = 1 в известном и и 4 в предлагаемом способах).

Пример 1. Количественное определение аденозин-5 -монофосфорной кислоты (ЛИФ). N 347,23; РН 7,5;

t 40 С.

В коническую колбу емкостью 250 мл помещают навеску препарата, равную

8,68 мг и растворяют в 10 мп дистиллированной воды. К полученному раствору прибавляют 15 мл 0,025 N раствора периодата натрия в воде, перемешивают содержимое колбы и оставляют на 10 мин в защищенном от прямого солнечного света месте. Потом прибав834512 ляют 2 мл 4 М раствора гидрохлорида бутнламина, нейтрализованного до рН 7,5 0,1 M раствором NaOH (контроль рН осуществляют рН-метром) и реакционную смесь 1 ч выдерживают в водяной бане при 40 С. Затем в коло бу вносят 25 мл буферного раствора на 1 М раствора монохлоруксусной кислоты и NaOH с рН 3,0 и 8 мл 2 M раствора молибдата натрия и тщательно перемешивают ее содержимое. Наконец, прибавляют 5 мл 20Ъ-ного раствора иодида калия, перемешивают содержимое колбы и через 2 мин выделившийся иод титруют 0,0250 н. раствором тиосульфата натрия. К концу титрования прибавляют 2 капли 0,5Ъ-ного раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновения сине-розовой окраски раствора. Расход титранта (V ) составляет 24,94 мл.

Холостой опыт (без навески опре- 20 деляемого вещества) проводят аналогично. Расход титранта (Ч ) составляет 2,14 мл.

По формуле (1) вычисляют содержание ÀMÔ. 25 (24,94-2,14) 347 23. 0 250 „

8,68 4 б

30 100 = 95,0Ъ

Определено 25 мкмоль АМФ с точностью 0,8Ъ.

Пример 2. Количественное определение цитидин-5 -монофосфорной кислоты (ЦМФ). М 323,20; рН 7,0;

35 С.

В коническую колбу емкостью 250 мл помещают навеску препарата, равную

7,92 мг и растворяют в 5 мл дистиллированной воды. К полученному раст- 4О вору прибавляют 10 мл 0,025 M раствора периодата натрия в воде, перемешивают содержимое колбы и оставляют на 15 мин в защищенном от прямого солнечного света месте. Потом при- 45 бавляют 1 мл 4 M раствора гидрохлорида метиламина, нейтрализованного до рН 7,0 0,1 М раствором йаОН в воде (контроль рН осуществляют рН-метром) и реакционную смесь 1,5 ч выдерживают 50 в водяной бане при 35 С. Затем в колбу вносят 20 мл буферного раствора из 1 М раствора монохлоруксусной кислоты и NaOH с рН 3,0 и 5 мл 2 М раствора молибдата натрия и тщательно перемешивают ее содержимое. Наконец, прибавляют 5 мл 20%-.ного раствора иодида калия, перемешивают содержимое колбы и через 1 мин выделившийся иод титруют 0,0250 н ° раствором тиосульфата натрия. К концу титрова- 60 ния прибавляют 2 капли 0,5В-ного раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновения сине-розовой окраски раствора. Расход титранта (V ) составляет 20,20 мл.

Холостой опыт (беэ навески определяемого вещества) проводят аналогично. Расход титранта (Н ) составляет 3,00,мл.

По формуле (1) вычисляют содержание ЦМФ. (20 20-3,00). 323 20 0 0250 „

7,92. 4 ° 6

> 100 = 79, 9%

Определено 24,5 мкмоль ЦМФ с точностью 0,6Ъ.

H p и м е р 3. Количественное определение уридин-5 -монофосфорной кислоты динатриевой соли (УМФ.-NaOH).

М 368,15; рН 6,5; t 37 С.

В коническую колбу емкостью 250 мл помещают навеску препарата, равную

9,20 мл и растворяют в 5 мп дистиллированной воды. К полученному раствору прибавляют 10 мл 0,025 И раствора периодата натрия в воде, перемешивают содержимое колбы и оставляют на

15 мин в защищенном от прямого солнечного света месте. Потом .прибавляют 5 мл 4 М раствора гидрохлорида метиламина, нейтрализованного до рН 6,5 0,1 М раствором йаОН (контроль рН осуществляют рН-метром) и реакционную смесь 2 ч выдерживают в водяной бане при 37 С. Затем в колбу о вносят 20 мл буферного раствора из

1 М раствора монохлоруксусной кислоты и Na0H с рН 3,1 и 5 мл 2 М раствора молибдата натрия и тщательно перемешивают ее содержимое. Наконец, прибавляют 5 мл 20%-ного раствора иодида калия, перемешивают содержимое колбы и через 3 мин выделившийся иод титруют 0,0250 н ° раствором тиосульфата натрия. К концу титрования прибавляют 4 капли 0,5%-ного раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновения сине-розовой окраски раствора. Расход титранта (V ) составляет 20,78 мл.

Холостой опыт (без навески определяемого вещества) проводят аналогично. Расход титранта (V< ) составляет 1,44 мл.

По формуле (1) вычисляют содержание УМФ-йа . (20 78-1 44) ° 368,15 0,0250 уМФ Na2.—

9,20 °

1 100 = 80,6Ъ

Определено 25 мкмоль УИФ-йа с точностью 0,5%.

Формула изобретения

Способ количественного определения нуклеозид-5 -монофосфатов путем

l обработки анализируемой пробы раствором периодата натрия, раствором

834512

Составитель Л. Соломенцева

Техред И. Асталош Корректор Р. Назарова

Редактор 0. Ковач

Заказ 4059/66

Тираж 907 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, %-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. ужгород, ул. Проектная, 4

L молибдата натрия при рН среды 2,93,1 и раствором иодида калия с последуюшим титрованием полученного раствора тиосульфатом натрия в присутствии крахмала, о т л и ч а ю"шийся тем, что с целью повышения чувствительности определения, полученный после обработКи периодатом натрия нуклеоэид-5 -монофосфатдиальдегид дополнительно обрабатывают метиламином или бутиламином при рН среды 6,5- ><

7,5 и температуре 35-40 С при мольном соотношении нуклеоэид-5 -монофосфатдиальдегид : периодат натрия : метиламин или бутиламин, равном 1!10—

15:160 — 800.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

Ю

1. Ультрамикроанализ нуклеиновых кислот. Под ред. Д.П. Кнорре. М., "Наука", 1973, с. 95-133.

2. Бусев A.È., Захаранс В.Я., Иикстайс У.Я. Определение 4-гликольиой группировки в компонентах нуклеиновых кислот. ll. Новый амплификационный метод титриметрического определения рибонуклеозидов и нуклеозид-5 -фосфатов. "Химико-фармацевтический журнал", 1977, Ф 3, с. 128-132 (прототип).