Способ получения изолимонной кислоты

 

- ч „

В.И..Илларионова, Л.И.Глазунова, Н.В.Шишканова, * """" -"

Т.В.Финогенова и А.Б.Лозинов

I .. -., с р4 !

Ы .,, -...,-, ф

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН CCCP (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОЬ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОЛИИОННОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно .к способу получения изолимонной кислоты, используемой в раз- . личных отраслях промышленности, наS, пример медицинской, химической и др.

Изолимонная кислота метаболически близка лимонной кислоте и может найти применение в тех же областях ,народного хозяйства, где использу- 10 ется последняя, и производство которой не обеспечивает в достаточной степени потребности в ней (электррнная, металлургическая, текстильная промышленность; прН производстве поверхностно-активных веществ, а также синтетических моющих средств вместо триполифосфатов натрия и калия, загрязняющих фосфором водные 2в бассейны}. Изолимонная кислота ис.-. пользуется как биохимический препарат в исследовательной работе, однако . стоимость ее очень высока, 2 что значительно ограничивает области ее применения. . Известен способ получения изолимонной кислоты с использованием дрожжей вида Candida 1ipolytiñà, предусматривающий выращивание их на питательной среде при аэрации среды, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли (1). Наряду с изолимонной кислотой в ферментационной среде обнаруживают.и лимонную кислоту.

Известен также способ производства, изолимонной кислоты при культивиро- вании дрожжей Candida brumptii 1ГО

0744 в питательной среде с н-гексадеканом (60 г/л), получают 30,0 r/л иэолимонной кислоты (с выходом 503 от внесенного алкана), лимонной кислоты в среде не обнаруживают (-).

Наиболее близким техническим ре" шением к описываемому по достигаемому эффекту является способ получения

2,0 мл

3 84978 йзолимонной кислоты путем культивирования дрожжей вида- Candida lipoly"

tica в условиях аэрации на питательной среде, содержащей этиловый спирт, в качестве единственного источника углерода, азот, фосфор и минеральные соли (3).

При культивировании дрожжей

Candida lipolytica на питательной среде, содержащей 2,03 этаноМ, вы- 1р ход изолимонной кислоты составляет

60-663 от внесенного субстрата.

Рассматриваемый способ не обеспечивает достаточно высокого выхода изолимонной кислоты. 15

Целью предлагаемого изобретения является повышение выхода и концентрации изолимонной кислоты.

Поставленйая цель достигается тем, что в способе получения изолимонной кислоты, предусматривающем культивирование дрожжей аида Candida lipoly.tica s условиях аэрации на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минераль- 2S ные соли, в питательную среду в процессе культивирования вносят ингибитор изоцитрат-лиазы в концентрации

1,0 66,0 мм.

При этом, в качестве ингибитора 3© используют итаконат или оксалат натрия, а в качестве источника углерода - нормальные парафины или этанол.

Использование предлагаемого способа позволит наладить производство изолимонной кислоты из вышеперечисленных источников углерода с выходом этого продукта, превышающим все известные достижения в этой области.

Добавление к ферментационной среде итаконата или оксалата даже в небольших концентрациях сдвигает соотношение накапливаемых в растворе лимонной и изолимонной кислот в сторону изо" лимонной, что облегчает процессы выделения в химочистки последней.

Пример 1. Дрожжи Cand da l i poly t i ca ИБИФ У-160 поддерживают на агаризованной минеральной среде

Ридер с нормальными алканами (С1 Сщ) имеющей следующий состав, г/л:

Нормальные алканы са- С 8,0 (NH у ) 504 3,0

Ид50 7Н О 0,7

КаС 1 0 5

Ca(Ц0 ) 0,4

Ю Р04 1,0

0 4

К НР01 0,1

Агар-агар 25,0

Дрожже вой автолизат

Смесь микроэлементов по

Буркгопьдеру 50мл

Набор микроэлементов по Буркголь" деру включает следующие"компоненты (мг/л среды):.К1-0,1; В - 0,01;

МФ+" 0,01 2п т- 0,01; СР - 0,01;

Дрожжи выращивают на скошенном агаре в течение двух сут при 28" 30 С., о

Водную суспензию клеток с агаризованной среды переносят в колбы объемом

750 мп, содержащие 50 мл посевной среды следующего состава, г/л: н-гексадекан . 8,0 (NH44.

Ид50д. 7Н 0 0,7

НаС 0 5

Са(ЙО ) 0,4

КХНР.04 . О, 1

Тиамин 500 мкг

Смесь микроэлементов 5,0 мл

Выращивание проводят 48 ч на качалке (260 об/мин) при 28-30 С. Полученный посевной материал вносят в количестве 2Ф в среду для ферментации, которая осуществлялась также в колбах обьемом 750 мл с 50 мл среды аналогичного состава.

Через 24 ч от начала культивирования в колбы вносят итаконат натрия в различных концентрациях. рН среды поддеркивают 5,5-6,5 путем добавления 103 йаОН. В табл.1 приведены результаты, полученные после четырех сут культивирования.

Из таблицы видно, что добавление в среду итаконата приводит к изменению соотношения накапливаемых кислот в сторону изолимонной кислоты (по сравнению с контролем) и тем самым повышает выход последней от использованного субстрата.

ll р и м е р 2. Дрожжи Candida

1ipolytiña ИБФИ У-160 поддерживают и выращивают на питательной среде того же состава, как описано в примере 1.

Через 24 ч культивирования в опытные колбы вносят оксалат натрия в различных концентрациях. В табл.2 приведены результаты определения со90,0

2,4

1,4.0 5

0,8

2,0

0,2

3,5

500,0 мкг

5,0 мл

5 - 8497 держания в культуральной жидкости лимонных кислот после. 96 ч культивирования.

Полученные данные показывают, что использование оксалата также повышает $ выход изолиманной кислоты.

Пример 3.,Дрожжи Candida

liро1уйiса. ИБИФ У-160 поддерживают на агаризованной минеральной среде

Ридер, имеющей такой же состав,как в примере 1. В качестве источника углерода использукн этанол (10,0 г/л).

Культуру выращивают на скошенном агаре в течение трех сут при 28-30 С, Водную суспензию клеток с агаризован- 1$ ной среды переносят в колбы объемом .

750 мл, содержащие 50 мл посевной среды.

Среда для получения посевного ма": териала имеет следующий состав, г/л: 2В (W+)

Мд50 7Н,О 0,7

NaC l 0,5 .

Ca(но ) 2 0,4

КН, Р04 1,0 2$

К " 04, Этанол 10,0

Тиамин . 500 мкг

Смесь микроэлементов 5,0 мл

Выращивание проводят 48 ч на качалке(260 об/мин)при 28-30 С. Полученную посевную .культуру переносят в новую партию колб со средой того же состава в количестве 5Ж от объе" ма среды.

Через 24 ч от начала культивирования в колбы вносят итаконат натрия в концентрации 5 мИ. рН среды во время культивирования поддержи- щ вали равным 5,5-6,5 введением раствора Na0H.

Через 5 сут культивирования в среде накапливается 7,2 г изолймонной кислоты и 2,0 r лимонной кислоты в 1 л. Выход изолимонной кислоты составляет 723 от внесенного субстрата.

В колбах без добавления итаконата обнаруживается 6,4 r изолимонной и

2,4 лимонной кислоты.

Пример 4. Дрожжи Candida

lipolytica И6ФИ У-lбо.выращивают на скошенном-агаре, как в примере 1.

Водную суспензию клеток с агаризован«$$ ной среды переносят в колбы объемом

750 .мл, содержащие 50 мл посевной среды следующего состава, г/л:

80 6

Нормальные парафины (c„ - („ ) 24,0 (ИН ) 5а, 2,0

MgS04 7н,о 0,7

NaCl 0,5

Са (НО ) 0,4 кн Р04 l,0

К<НРО4 0 г1

Соль Мора .3 5мг

Тиамин 500„9 мкг

Смесь микроэле-. ментов 5,0 мл

Через 48 ч инкубации на качалке (260 об/мин ) полученную посевную культуру переносят в новую партию колб с посевной средой, объем ино- кулюма - 5Ф от объема среды.

500 мл выросшей культуры переносят в ферментационную среду (3,5 л ) сле" . дующего состава, г/л:

Нормальные парафины (С -С ) (нн4) 6о ид5ф7н о

NaCl

Ca(NО ) кнР04

К2НР04

Соль Иора

Тиамин . Смесь микроэлементов

Через 24 ч и 50 ч от начала кулв тивирования в ферментационную среду добавляют итаконат натрия в концентрации 5,0 г/л (конечная концентрация итаконата 10,0 г/л). ферментацию проводят в ферментационном аппарате -при постоянном перемешивании и поддержании концентрации кислорода в среде 75-853 насыщения. рН среды поддерживают на уров" не 5,5-6,5 введением раствора йаОН.

Через 144 ч культивирования в среде накапливается 67,0 г/л изоли-.; монной кислоты и 29,0 г/л лимонной кислоты. Кроме того определено

23,4 г/л неиспользованного парафина.

Выход изолимонной кислоты от потребленного субстрата составляет 1003.

Соотношение лимонной и изолимонной кислот - 1:2,3 °

При проведении ферментации на питательной среде, содержащей 72,0 г/л нормальных парафинов без добавления итаконата, накапливается 48,5 с изолимонной кислоты (выход 67,34 от

Итакойат натрия, мИ

Измеряемый параметр

Контроль

Лимонная кислота, r/cP

2 5

Изолимонная кислота, г/л

6,0 6,4

62 68 50

5,0

Выход изолимонной

/ кислоты от субстрата, 62,5 62,5

75

62

Соотношение кислот лимонная:изо1:1,2 1:2 лимонная

««« ««««« ««

Таблица 2.Измеряе парамет

Контр

Лимонная кислота,г/л

3,3 3 5

4,5 4,0 3,8

4,0

3.3

Изолимонная кислота, г/л 5 0

6,6 6,4

5,4

6,8

6,8 6,6

7 8 . субстрата ) и 54,0 лимонной кислоты.

Соотношение кислот 1: 1.

Пример 5. Выращивание дрожжей на скошенном агаре, получение. посевного материала и ферментационный процесс осуществляют, как в при,мере 2. Ферментационная среда содержит нормальные парафины С - С в концентрации 100,0 г/л. ю 9

Через 24 ч и 50 ч культивирования в среду вносили соответственно ..

2,0 г/л и 3,0 г/л итаконтата натрия (конечная концентрация итаконата -

5,0 г/л).

После 144 ч культивирования в ферментационной среде обнаруживают

68,3 г/л изолимонной кислоты и

33,7 г/л лимонной кислоты). Концент" рация остаточного парафина в среде -, 37,8 г/л. Выход изолимонной кислоты от использованного. субстрата Составляет 109,83. Соотношение лимонной и изолимонной кислот равно 1:2.

49780 8

Выход лимонных кислот и их соотношение при культивировании дрожжей на среде без добавления итаконата был таким же, как описано в приме" з ре 4.

Внесение в ферментационную среду итаконата или оксалата натрия в концентрациях от 1,0 до 6,Î мМ сдвигает соотношение экстретируемых

14 дрожжами лимонных кислот в сторону преимущественного накопления изолимонной кислоты, повышая, тем самым, ее концентрацию в ферментационном растворе, а это, в свою очередь,при1 водит к тому, что значительно облегчаются процессы выделения этой кислоты из раствора и последующей мим-. очистки. Использование данного способа позволит одновременно повысить

20 концентрацию изолимонной кислоты в растворе и ее выход, что приведет в снижению ее стоимости и расширению области ее применения.

Т а б л и ц а 1

1,7 1,75 1,75 1,5 1,8

l:3,5 1:3,6 . 1:3,5 1:4,5 .1:3

849780

Продолжение табл. 2

J П.

Измеряемый параметр

Контроль

1 5 10 20 40 60

Выход изолимонной .кислоты от субстрата, Ф

85 82,5

62 5 68:. 82 5 80

Ь

Соотношение кислот лимонная:изолимоннал 1: 1,2 1: l,2 1: 1,6 1: 1,7

1:2,1 1:2,1 l:1,9

Составитель М.Ларина

Редактор Е.Зубистова Техред А. &абинец Корректор У.Пономаренко

Заказ 10784/7 Тираж 521 Подписное

8НИИПИ Государственного комитета СССР

flo делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

»

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, Формула изобретения

1. Способ полуумения изолимонной кислоты путем культивирования дрожжей вида Сапд1па lipolytica в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, форфора и минеральные соли, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в питательную среду в процессе культивирования вносят ингибитор иэоцит" рат-лиазы в концентрации.1,0"60,0 мМ. +

2. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и Й с я тем, что в качестве инги-.

«»»ФЪ битора используют итаконат натрия или оксалат натрия.

3. Способ по и.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве источника углерн да используют нормальные парафины или этанол.

Источники информации, принятые во внимание при,экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

Н 305187, w. С 12Э 1/04, 1968.

2. Патент Франции Н 1596056, кл. С 12 d опублик. 1970.

3. Авторское свидетельство СССР по заявке . 2844702/13, кл. С 12 Р 7/48, 1979.