Способ получения носителей для иммобилизации белковых веществ

 

Союз Советскик

Социалистическмк

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6l) Дополнительное к авт. свнд-ву(22) Заивлено 05,12,79 (2! ) 2846899/23-04 с присоединением заявки М— (51)M. Кл.

С 08 G 69/14

С 08 С 69/48

С 08 Р 20/44//

С 12 N 11/08

1Ьоудлротеаииый комитет

СССР ио аелам изобретений н открытий (23) Приоритет

Опубликовано 23.08.81. Бюллетень М31 (53) УДК 541.64. .577. 15 (088.8) Дата опубликования описания 26.08.81

Г. И. Денис, М.-Б. В. Мейзерайтиге, Ю. Ю. )Кулис, Э. В. Ралис, В. И. Краняускас. В. Г. Мурыгин, А. С. Ви щбнас", И. И. Кюдулас и В. И. Лауцюс

I (72) А вторы изобретения (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной-— энэимологни (S4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ

БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ о

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам получения носителей для иммобилизации биологически активных белковых веществ (ферментов, пептидных гормонов, антител).

Известен способ получения носителей дпя иммобилизации белковых веществ путем модификации полиамидного нерастворимого носителя-найлона, обработкой его димегилсульфатом при 100 С в щелочной среде с.послелующей промывкой абсолют т ным этанопом ), Однако при активации димегилсульфат быстро растворяет найлон, резульггом,чего является ухудшение качества но снтеля. Кроме того, димегилсульфаг — выi$ сокогоксичное вещесгво, что эатрудняег осуществление способа в производственном масштабе.

Цель изобретения — улучшение качесгМ ва носителей и обеспечение безопасности процесса.

Поставленная цель достигается способом получения носигелей для иммобили

2 эации белковых веществ, заключающимся в модификации нерастворимых пааимеров с азогсодержащими функциональными группами путем обработки их воссгановигепями в среде органических .растворителей при 40-160оC.

Обычно в качестве вьинеуказанных по димеров использузот полиамидные (например капрон, натуральный meaa) или попинитрильные, например поезиакриионитр»ц) полиме, ры, в качестве сизганических раствсригелейдиэгнповый эфир, гетрагидрофуран, н-бу:гиповый спирт, тоезуон, диметиловый эфир эгипенгликопя, днметиповый эфир диэгиленгликопя или смесь последнего с диоксаном, а s качестве восстановителей используют комплексные металлога ришя (в частности питийалюминийз»дрид и натрийборгидрид) в копичестезе 2-15.ь от веса полимера»л» металлический натрий в количе,стве 20-40% от веса полимера и процесс ведут соответственно при 40-160 С или при 80-120®Ñ, причем в последнем сл чае в присутствии спирта.

3 85715

Существенным отличием способа является то, что модификацию указанных полимеров проводят путем обработки их воссгановйтелями в среде органических растворителей при 40-160 С.

Способ осуществляют путем нагревания полимеров и восстановителей в среде указанных выше растворителей в указанномтемпературном .интервале,.

При активации полимеров комплексными 0 металлогидридами растваритель должен хо Н бы частично растворять восстановигель, но не вступать с ним в химическое взаимодействие или вступать лишь очень медленно. Этим требованиям удовлетваряют указанные фпротонные полярные растварители - диэгиловый эфир, тетрагидрофуран, диоксан, диметиловый эфир этиленгпиколя.

При активации щелочными металлами в присутствии спиртов подходящими являются любые инертные растварителй, имеющие достаточно высокую температуру кипения для тонкого диспергирования металла. В случае металлического натрия в качестве растворителя удобно применять толуол.

- В зависимости от типа полимера и используемого восстановителя предпочтительные условия модификации варьируют в широких пределах.

В ходе процесса модификации восстанавливаются азотсодержащие функциональные группы поверхностного слоя полимеров.

Амидные группы восстанавливаются до вторичных аминогрупп, нитрильные группы— до первичных амйногрупп о 35

Я-СО-ЯН-a - И-СК -ИИ-а

II 1 -см - Р-Ситйн2.

К образовавшимся первичным йпи вто40 ричным аминогруппам можно присоединить белковые вещества непосредственно ипи через вставки. В качестве вставок предпочтительно использовать полифункционапьные растворимые полимеры (например по45 лиакриловую кислоту, попиэгиленимин). Иммобилизацию белковых веществ осуществляют при помощи связывающих реагентов, образующих ковалентные связи между функциональными группами поверхностного слоя носителя и белковых молекул (например

50 водорастворимого, карбодиимйда, глутарового альдегида, иминоэфиров дйкарбоновых кислот) .

Описываемый способ дает возможность получить носители в виде тонких йленок и тканей, что является удобным во многих областях применения. Это невозможно получить по известному способу, гак как при

4 нагревании с диметилсульфатом полиамидные йолимерйые пленки или ткани теряют прочность и разрушаются.

Пример 1. В 20 мл абсолютного тетрагидрофурана помещают 150 мг кап» роковой ткани, добавляют Ф2 мг литийалюминийгидрида и кипятят в течение 20ч (при 65 С). Ткань промывают водой (Зх 25 мл), О, 1 и НСВ(2х25 мл), снова во- дой (4х25 мл) и высушивают на воздухе.

Активированный капрон помещают в 15мл

5%-ного. раствора полиакриловой кислоты в

0,05 М фосфатном буфере, рН 10, и добавляют 25 мг связывающего реагенга (1-циклогексил- (3-(2-морфалиноэт ил) )-карбодиимид метил-п-голуолсульфонага) . Pe акционную смесь выдерживают при комнатной температуре 3 ч . Капрон промйвают 0,05 М фосфатным буфером, рН 10, водой, помещают в 3 мл высокоочищенной глюкоэооксидаэы в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7 (концентрация белка 1мгlмл), и добавляют ЗО мг того же связывающего реагента, Реакционную смесь выдер- живают при +3 С 12ч,i, капрон промывают 0,01 М фосфатным буфером, рН 7. Ферментативная активность 65 Е/г.

Пример 2. К 30 мл смеси абсолютного диоксана и абсолютного диметилового эфира диэтиленгликоля (2:1) добавляют 16 мг нагрийборгидрида, помеща рг

800 мг порошкообразного капрона. Через несколько минут добавляют 0,02 мл четыреххлорисгого титана и кипятят 3 ч (температура омеси 120ОC). Капрон промывают водой (Зх35 мл), 0,1 н НС ; (2х35 мл), снова водой (4х35 мл)и высушивают на воздухе. Активированный капрон помещаю в 20 мл 5%ного pacraapa полиэтиленимина в 0,1 М фосфатном буфере, рН 8,5, и добавляют 80 ка связывающего реагента (дигидрохлорида диметилсуберимидата). Реакционную смесь выдерживают при О С 1 ч. Промывают

0,01 М фосфатным буфером, рН 8,5, помещают в 15 мл раствора очищенной ще- лочной протеазы в 0,01 М фосфатном буфере, рН 9 (концентрация белка 1 мг/мл) и добавляют 80 мг того же связывающего реагента. Реакционную смесь выдерживают при +5оС 15 ч. Промывают

0,01 М фосфатным буферам, рН 9. Ферментагивная активность 9 E/r.

Пример 3. В 25 мл абсолютного димегиловаго эфира этиленгликоля помещают 200 мг полиакрипонитрильного во- локна, добавляют 20 мг литийалюминийгидрида и кипятят 5 ч (температура сме5 8571 си 83ОС). Полиакрипонитрип промывают водой (Зхзо мп), 0,1 н НСЕ (2x30 un), снова водой (4хЗО мл) и высушивают на воздухе. Активированный поляакрилонигрил помешают в 10 мл высокоочишенной гпюкозооксидазы в 0,1 М фосфагном буфере, рН 7 (концентрация белка 1 мг/мл) и добавляют 0,2 мл 4%ного раствора глутарового альдегида. Реакционную смесь выдерживают при 3 С 12 ч. По- 1о лиакрилонитрил промывают 1,01 M фосфатным буфером, рН 7. Ферменгативная активность ÇI Е/г.

П р я м е р 4. В 45 мл абсолютного толуопа помещают 120 мг металлического т натрия и кипятят при перемешивании до расплавления натрия. B реакционную смесь добавляют 400 мг полиакрялнитриловой ткани и кипятят 30 мин, добавляя при этом небольшими порциями 15 мл 2о н-бутипового спирта (гемперагура смеси о

110 С). Полиакрилонигрил промывают в дой (Зх45 мл), 0,1 н НСС (2х45 мл) и высушивают на воздухе. Активированный попиакрилонитрял помещают в 25 мл 25

5%ного раствора гексаметилендиамина в 0,05 М фосфатном буфере, рН 8,5. Реакционную смесь выдерживают при 0 С 1 ч.

Попиакрялонитрил промывают 0,05 М фосфатным буфером, рН 8,5, водой, помеша- Зо ют в 20 мл раствора высокоочяшенной инвертазы в 0,1 М ацетатном буфере, рН 4 (к жценграция белка 1,5 мг/мл), и добавляют 0,2 мл 4%-ного раствора глутарового альдегида. Реакционную смесь вы- as держивают при 5оС 12 ч. Полиакрипонигрил промывают 0,1 М ацегатным буфером, рН 4. Ферментативная активность 52 Е/r.

Пример 5. В 25.мл абсолютного диметилового эфира диэтиленгликопя номе° шают 400 мг капроновой пленки, добавляют,8 мг литийапюмянийгидрида и кипятят

3 ч,(температура смеси 160 С). Капрон промывают водой (Зх20 мл), 0,1 í НСЯ (2х20 мп) снова водой (4х20 мл) и въФ45 сушивают на воздухе. Акгивированный капрон помещают в 10 мл 5%-наго раствфа полиакриловой кислоты в 0,05 М фосфатном буфере, рН 10, добавляют 20 мг связывающего реагента (1-циклогексип-13-(2-морфопиноэт ил)) -карбодиимяд метни-п-толуоисульфоната). Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре Зч.

Капрон промывают 0,05 М фосфатным буфером, рН 10, водой, помещают в 3,5ми раствора комплекса иммуноглобулин-перо. ксидаза в 0,01 М фосфагном буфере, рН

7,2 (концентрация белка 0,8 мг/мп), и

59 0 добавляют 10 мг гого же связующего реагенга. Реакционную смесь выдерживают при 4оС 12 ч, капрон промывают 0,01 M фосфагным буфером, рН 7,2, 0,01 М фосфагным буфером, рН 7,2, содержащим

1 М КС, и снова 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,2. Ферментативная активность

45 Е/r.

Пример 6. В 20 мл абсолютного диэтилового эфира помешают 120 мг натурального шелка, добавляют 15 мг иит ийалюминийгидрида и кипятят 12 ч (температура смеси 40 С).Ткань промывают водой (Зх25 мл), 0,1 í НС6 (2х25 ми), снова водой (4х25 мп) и высушивают на воздухе. Актнвированный шеик помешают в 3 мл раствора инсулина в 0,01 М фосфагном буфере, рН 7,2 (концентрация белка 1 мг/мл), и добавляют 10 мг свя- . зующего реагента (2-цикпогексии-(3-(2

-марфолиноэгял)) -карбоднимид мейит- и-то пуопсульфонат). Реакционнуто смесь выдерживают яря 3 С 12 ч, шелк промывают

0,01 M фосфагным буфером, рН 7,2, сожержащнм 1 М KCf; и снова 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,2. Лпя визуализации RMM06N1393oBaBHoFO гормона образец обрабатывают ангигелом - комплексом иммуногиобупина-пероксидазы в 0,01 М трио-HCE буфере, рН 7,2 (концентрация антитела 0,8 мг-ми, обьем pacreopt

1,1 мп) 3 щса. Неассоцинрованный белок отмывают 0,01 М тряс -НСь буфером, рН

7,2, содержащим 1 М KCC и 0,01 М

; грнс-НСт буфером, рН 7,2. Акгнтиосгь ассоциат а 34:Е/г.

° Таким образом, описываемый способ получения носатеией дпя иммобилизации бепковык веществ обеспечивает неизменность механической прочности носителя после активации исходного полимера воощзонзводимосгь активации, гак как процесс проводят и более мягких условиях н боиее продоижитеиьное время, и увеличение безопасности яроцесса, гак как искиючаегся щтнмененне высокогоксивтого днметнисуиъфата.

Формула изобретен as

1. Отособ поиучення носягелей дпя иммобилизации байковых веществ путем модиФикацнн нерастворимых яатнмеров с азотсодвржащнми функциональными группами aps повытпенной температуре, о r л и« ч а ю m и и с я тем, что, с цепью улуч щения качества носитепей и обеспечения

Составитель О. Сксродумова

Техред М. Коштура Корректор М. Демчик

Редактор Н. Лазаренко

Подпйсное

Заказ 7139/38 Тираж 530

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4

7 857159 8 безопасности продесса, модификацию попи- венно при 40-160"С или при 80-120ОС, меров проводят путем обработки их вос- причем в последнем случае в присутствии становителями в среде органических раст- спирта. ворителей при 40-160 С. о

3. Способ по п. 1, о т л и ч а ю—

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю — > шийся тем, что в качестве полиамидшийся тем, что в качестве нераство- -иы. полимеров используют капрон .или римых полимеров с азотсодержащими функ- натуральный шелк, а в качестве полинитциональными группами используют поли- рильного полимера - полиакрилонитрил. амидные или полинитрильные полимеры, в 4. Способ по и. 2, о т л и ч а ю— качестве органических растворителей — ди-ig шийся тем, что в качестве металлоэтиловый эфир, тетрагидрофуран, н-бутило- гидридов используют литийалюминийгидвый спирт, толуол, диметиловый эфир эти- рид или натрийборгидрид. ленгликоля, диметиловый эфир диэтиленгли- Источники инфармадии, коля или смесь последнего с диоксаном, а принятые во внимание при экспертизе в качестве восстановителей используют i s 1. 7.Сс ерЬЕИ,%.E.Hce пЪУ et а(, Ию комплексные металлогииц иды в количест- 1>е ргерси"сИлои of Several иец пчве 2-15% от веса полимера или металли- сои tube- RuCOSe OXidaee йе 1чсИ 1ческий натрий в копичестве 20 40% от Wee ", ЮОСМФ1СО et, Ь ОРИЧЧСа ACta, веса полимера и apcmecc ведут соответст- 1975, 304, с. 307-316 (прототип).