Способ хроматографического разделения смеси пурин-и пиримидинсодержащих соединений

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Соеетскид

Соцнааистичеснмк

Реснубпнк ро857856 (61) Дополнительное к авт. свыд-ау (22) Заявлено 0509.79 (21) 2822278/23-04 с присоединением заявки М (23) Приоритет

Опубликовано 23f) 881.Бюллетень 8о 31

Дата опубликования описания 230881 (5 )м. к,.з

6 01 и 31/08

Государственный комитет

СССР

flo делам изобретений и открытий (53) УДК 543. 544.. 42 (088. 8) (72) Авторы изобретения

Г. A.aëåéíèêîâà, А.П. Башкович, Н.В. 3ах

М.A.Ìàëêos и И.М.Терешин

Всесоюзный научно-исследовательский т институт антибиотиков и ферментов мед (74) Заявитель (54) СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ СМЕСИ

ПУРИН- И ПИРИМИДИНСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ

Изобретение относится к химии и технологии получения пурин- и пиримидинсодержащих соединений, конкретно к методам их анализа и препаратив5 ного выделения.

Известен способ хроматографического разделения смесей пурин- и пиримидинсодержащих соединений в смеси растворителеи третамиловый спирт, му- о равьиная кислота и вода 11 .

Недостаток этого способа — неполнота разделения пурин- и пиримидинсодержащих соединений в присутствии различных примесей.

Известен также способ хроматографического разделения смеси пурини пиримидинсодержащих соединений в смеси растворителей н-бутанол, ацетон, ледяная уксусная кислота, 5% раствор аммиака, вода, взятых в соотношении

9!3:2:2:4 f2).

Недостатком известного способа asляется его невысокая эффективность в присутствии примесей органической и неорганической природы.

Цель изобретения состоит в повышении эффективности разделения сме-!

СИ ° укаэанная цель достигается тем, что согласно способу хроматографи- ЗО ческого разделения смеси пурин- и пиримидинсодержащих соединений в растворителе, в качестве растворителя, используют 0,005-0,05 M раствор трилона b или смесь, содержащую, об.Ъ:

25Ъ-ный водный раствор аммиака 5-10

0,02-0,05 М раствор трилона Б 15-30

Изопропиловый спирт До 100 или смесь, содержащую, об.В:

25%-ный водный раствор аммиака 25-35

Ацетон 10-25

0,02-0,05 М раствор трилона Б 15-25

Иэопропиловый спирт До 100

В качестве объектов исследования были взяты пурнновые н пиримидиновые основания, нуклеозиды, а также нуклеотиды:

АТФ-аденоэин-5-трифосфат

АДФ-аденозин-5-дифосфат (АМФ-аденоэкн-5-монофосфат

УМФ-уриднн-5-монофосфат

УДФ-уридин-5 -дифосфат.

Пример 1. На две пластинки с закрепленным слоем силикагеля

"Силуфол-254" наносят 2-3 капли нативного раствора ATC . Помимо ATC в на857856

0,02 М

0101 M

0 005 М 3 опыт 2 дан в тексте (пример 9 4), тинном растворе содержатся в качестse балласта соли, пигменты, органичес- кие соединения. Элкирующую систему приготавливают следующим образом: берут 20Ú ацетона, ЗОВ 25%-ного водного раствора аммиака, 303 изопропилового спирта и 20% 0,05 М раствора трилона Б в воде, компоненты тщательно перемешивают взбалтыванием.

Для сравнения готовят контрольную систему без трилона Б, заменяя трилон Б дистиллированной водой. Пластинки опускают в камеры, насыщенные парами элюата, Через 40 мин пластинки вынимают, подсушивают и проявляют в ультрафиолетовом свете.

При хроматографировании нативного раствора в контрольной системе получают отрицательные результаты— все компоненты идут сплошной полосой.

В системе, содержащей трилон 20

Б (динатриевую соль этилвндиаминтетрауксусной кислоты), получают четкое деление на несколько, пятен.

По поло жению свидетелей основные пятна идентифицированы как AT@ (й.р = 0,35), АДФ(Яр=0,46) у AMC (Rq

0,55) и аденин (R< - 0,73) .

Пример 2. На две пластинки с закрепленным слоем силикагеля — "Силуфал-254" наносят 2-3 капли нативного раствора УМФ. Приготавливают следующую элюируюшую систему: ацетон 10%, 25%-ный водный раствор аммиака 34%, изопропиловый; спирт

3бВ, 0,02 М раствор трилона Б в воде 20%, компоненты тщательно пере- 35 мешивают взбалтыванием. Для сравнения готовят контрольную систему без трилона Б, заменяя его дистиллированной водой. Хроматографирование осуществляют по примеру 1. 4О

При хроматографировании нативного раствора в контрольной системе деление компонентов смеси отсутствует. В системе, содержащей трилон Б, получают четкое деление на несколько пятен. По положению свидетелей основные пятна идентифицированы как

УМФ (R = 0,45) и УДФ (В = Ор32)ю

Пример 3. На две полосы хроматографической бумаги наносят 3-5 капель нативного раствора АТФ, Элюирующую системУ готовят следующим образом: берут 10% 25%-ного раствора аммиака, 70% иэопропилового спирта и 20% 0,05 М раствора трилона Б в воде, тщательно перемешивают вэбалтыванием. Контрольная система включает 10% 25%-ного раствора аммиака, 70% изопропилового . спирта и 20% водые

Разделение проводят методом нисходящей хроматографии. Время разделения 11-12 ч. После .росушки хроматограммы проявляют в ультраФиолетовом свете.

При хроматографировании нативного раствора в контрольной системе получают отрицательные результаты.

В системе, содержащей трилон Б получают четкое деление на несколько пятен. По положению свидетелей основные пятна идентифицированы как соответствующие нуклеотиды (АТФ, АМФ, АДФ). R =0,07, R =0,10 R„ =О,15

В =5s57

Пример 4. На две полосы бумаги для хроматографии наносятся

3-5 капель гидролизата мицелия инозина. Элюирующей системой является

0,01 М раствор трилона Б. Для контроля готовят систему согласно известному способу, включающую три компонента: 12 частей бутанола, 3 части уксусной кислоты и 5 частей воды.

Разделение проводят методом нисходящей хроматографии. Время хроматографирования в контрольной системе составляет 16 ч, в растворе трилона Б

3 ч (при равных расстояниях линии фронта от линии старта в обеих хроматограммах), При хроматографировании нативного раствора в контрольной системе получают отрицательные рузультаты — все компоненты идут сплошной полосой, окрашенной в желтый цвет, обусловленный наличием пигмента.

В растворе трилона Б получают четкое деление раствора гидролизата на 4 пятна, идентифицированные как аденин, гуанин, тимин и цитозин.

R M70 MHP

Варианты элюирующих систем и результаты хроматографического разделения приведвны в табл, 1-3.

0 58 0,42 0,73. 0,84

0,56 О, 39 0,73 0,85

О 55 D 39 О 74 О 83

857856 Таблица 2

Элюирунщая система

Анализируем системе

Амми ак Трилон

Ос 32 Ос42 Ою50 0 70

25 Нативный раствор

АТЬ (МЭ, ЛДФ, АМФ, аденин) 25

1 25

2 30

0,35 0,46 0,55 0,73

20

0 40 0 75

35

3 40

25 Нативный раствор

УМФ (УМФ, УДФ) 4 25

25

0,43 0,35 б

36

0 45 0,32

34

0,44 0,38

15 н

35

6 40 4Опыт 2 дан в тексте (пример 1) .

Опыт 5 дан, в тексте (пример 2) .

Таблица 3

Анализ ируемый и компонентов системы раствор

АТФ АДФ АМФ Аде нин

Опыт Элюирующая система

Из опро- Аммиак Трилои Б пило вый спирт

0 06 0,10 0 54

Нативный раст- 0,04

Bop ATe (АТФ, АДФ, АМФ, аденин) 65

2 70

20

3 75 10

Опыт 2 дан в тексте (пример 3). ле, о т л и ч а ю щ и,й с я тем. что, с целью повышения эффективности разделения смеси, в качестве растворителя используют 0,005-0,05,М растФормула изобретения

Опособ хроматографического разделения смеси пурин- и пиримидинсодержащих соединений в растворитезопро- Ацетон илоый пирт

Ц компонентов системы

АТФ АДФ АМФ Аде- УМФ УДФ нин

0 07 0 ° 10 Ою15 0 57

0,08 О, 10 О, 12 0,58

857856

10-25

Составитель С.Хованская

Техред,C. Мигунова Корректср Н.Швыдкая

Редактор О.Малец

Заказ 7233/73 Тираж 907 Подписное

ВНИИПн государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППГ «Патент" г. Ужгород, ул. Проектная, 4 вор трилона Б нли смесь, содержащую об.Ъ!

25%-ный водный раствор аммиака 5-10

0,02-0,05 М раствор трилона Б 15-30

Изопропиловый спирт До 100 или смесь, содержащую, o6.%

25%-ный водный раствор аммиака 25-35

Ацетон

0,02-0,05М раствор хрнлона Б 15-25

Изопропиловый спирт До 100

Источники информации принятые во внимание при экспертизе

1. Хроматография в тонких слоях.

Под ред. Э.Шталь. М., «Мир", 19б5, с. 443.

2. Там же с. 445 (прототип).