Способ определения активности гормона тимуса

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Соввтским

Соцналис тически к

Республик (>858834 (61) Дополнительное к авт. санд-ву— (22) Заявлено 27. 12. 79 (21) 2862212/28-13 с присоединением заявки М (23) Приоритет (51) М. Кл.

А 61 К 37/24//

A 61 В 10/00

3Ъсударстваииы11 квинтет

СССР ио далзи изабуетеиий и аткрытий

Опубликовано 30.08. 81. Бюллетень М 32 (53) УД Кь616-07 (088.8) Дата опубликования описания 30. 08 . 8 1 (72) Авторы изобретения

В.А.Малыжев, Т.К. Валуева и Т.А. Самари а

Киевский научно-исследовательский инсти ут gi,,-, > эндокринологии и обмена веществ (7l ) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГОРМОНА

ТИМУСА

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности и касается определения активности лекарственных препаратов, которые могут найти применение в медицинской практике.

Известен способ определения активности гормона тимуса путем проведения реакции розеткообраэояания лимфоцитов под влиянием гормона тимуса с последующим инкубированием смеси и подсчетам роэеткообраэующих клеток (11.

Однако известный способ обладает недостаточно высокой чувствительностью, Цель изобретения — повышение чувствительности способа.

Укаэанная цель достигается тем, что способ определения активности гормона тимуса осуществляют пчтем проведения реакции розеткообраэования лнмфоцитов под влиянием гормона тимуса с последующим инкубированием смеси и подсчетом розеткообразующих клеток, для реакции розеткообраэования используют лимфоциты тимуса, иикубирование смеси проводят в присутствии теофиллина и по степени ингибирования розеткообраэования определяют активность гормона тимуса.

Способ осуществляют следующим образом.

Определение активности гормона тимуса складывается из следующих этапов работы: приготовление суспен зии клеток тимуса, приготовление зритроцитарной суспензии, постанов15 ка реакции и ее учет.

Тимус мышей любого пола возрастом

1-4 мес. измельчают на "холоду в среде для культур тканей (например, j0 среде 199) любым подходящим способом и клеточную взвесь фильтруют через тонкую стальную или капроновую сеточку.Затем клетки дважды отмывают средой, центрифугнруя при 400 д н те858834 чение 5-6 мин и готовят взвесь так, чтобы в 1 мл среды содержалось

30>10 лимфоцитов.

Для реакции используют эритроциты барана, которые хранят в растворе

Алсевера и непосредственно перед ее постановкой трижды промывают физиологическим раствором, центриФугируя при 500 д в течение 6-7 мин . Отмытые эритроциты суспензируют в культуральной среде в концентрации 250-300 млн клеток в 1 мл.

В центрифужные конические пробирки вносят по 0,1 суспензии тимических клеток и по 0,1 мл раствора гормона тимуса в различных концентрациях, причем одну и ту же концентрацию препарата как минимум в 4 пробирки. В контрольные пробирки вместо гормона

J вносят по 0,1 мл среды. Контрольные и опытные пробы ставят в термостат о на 37 С и суспензии клеток инкубируют в нем 30 мин. После этого в половину равноценных проб добавляют по

0,1 мл 10 M раствора теофиллина на

Q. среде, а в другую половину проб— только по 0,1 мл среды. Инкубацию в термостате продолжают еще в течение 2 ч, Затем пробы вынимают из термостата, в каждую из них добавляют по

0,1 мл приготовленной суспензии эритроцитов. Клетки перемешивают и центрифугируют при 200 д 5 мин.Клеточные осадки вместе с надосадочной жидкостью помещают в.холодильник на 1 ч при +4оС.

LIJM подсчета розеткообразующих клеток осадки ресуспендируют на вертикальном ротаторе при скорости вращенияя барабана 10 об/мин. в течени е

5 мин. Затем пипеткой отбирают каплю суспензии и переносят в счетную камеру, например, камеру Горяева, и подсчитывают число розеткообразуюших клеток во всей камере под микроскопом. Число розеткообразующих клеток

Р0К представляют на 10 лимфоцитов.

Сравнивают количество РОК в пробах с и без теофиллина и подсчитывают ингибирующее действие теоФиллина в процентах.

3а единицу активности гормона тимуса принимают то его количество (в весовых единицах), которое обеспечивает ингибирование образования POK теофиллином на 507., В таблице приведены результаты оценки активности тимозина (фракция V)

Как видно и з таблицы, по пр едлагаемому способу можно определить 0,05 мкг тимозина в пробе, тогда как чувствительность известного способа на порядок ниже. В соответствии с этим активность тимозина, определенная предлагаемым способом, составляет 20000 Ед, тогда как по известному методу — 2000 Ед на мг препара30 та.

Предлагаемый способ обладает больraeA чувствительностью, использование способа обеспечит возможность оперативного контроля его качества на всех стадиях производства и позволит стандартизировать выпускаемые серии rrре— парата.

8S8834! 1

Ф a3 Q) Х х а (» 1

Х Х (б 1- !»

u Z

< о

Х о о о

«"!

4

Х Х О М

° 1 I

8 1 о

1 A! Я

1 л

o I v

«lI 1 Х

«lj

I о

)Х о

Ы о

«ч о о

О О О с 1 о о о о

« 1 «с «4

СО 00 о 1 — —

Ш I (л о 1 о

0) 1 Я х сб

Ю

0) сО

Х х

1» о а о о

Ы

1 о Ю оо о г о

О1 о o o

«;О < U

О СО О сс! х а

М Х

М

° о Х ч о

ы х-. о о о о

«Ч

°, I»o

Г» 5 м х хо г

О Л

«4 с«1 г .О сО о о о

1 о

& I

Е 1

1 о д

««3 1 Ф

Ю

o o o о л о

QO

«Ч -Ф

o o

o o

О О л о сп

Eо

Ю о о о о

«О « 1

o o о о

o o о «ч

o o

О1

1 о а

1л о о л о о о о о о

I и 1

)х !

1» о

«У

Я I

>х

1 а>

«l1

«» с о »

1

)

i

Л

Э

:О

Z 2

QJ c) ".3

Cl

Ъ О3

v «U а

=1 х о х х сс! (М

X х л сЦ а «О

&

Х о о о

1 О сс \ « 4 Ос о и л л о

A ц х о х а « ) О х х

1.ч

858834

Формула изобретения

1О

Составитель С,Малютина

Редактор А.Власенко ТехредЛ,Пекарь Корректор В.Синицкая

Заказ 7395/13 Тираж 687 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППЛ "Патент", r . Ужгород ул. Проев гнея, Способ определения активности гормона тимуса путем проведения реакции розеткообразования лимфоцитов под влиянием гормона тимуса с последующим инкубированием смеси и подсчетом розегкообразующих клеток, отличающийся тем, что, с целью повьппения чувствительности способа, для реакции розеткообразования используют лимфоциты тимуса, инкубирование смеси проводят в присутствии теофиллина н ш> сгецеци ингибирования розеткообраэования определяют активность гормона тимуса.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

l. Bach. J.3., 0ardenne М., et

a11." Appearance of Т-СМ Markers in

Bone Marrow Rosette-Эопя1пу cells

after incubation with thymosin, а

Thymic Hormone", Proceeding Nature

Academia Science, USA, 1971,68,11, р. 27-34-2738 °