Среда для быстрой дифференциации токсинообразующих грибов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТРРСКРМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскик

Социалистйческин

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 141279 (21) 2851676/30-15 (53)М. КЛ.

С 12 и 1/14 с присоединением заявки ¹â€”

Государственный комитет

СССР но делам изобретений н открытий (23) Приоритет

Опубликовано 071081 Бюллетень № 37 (H) УДК576.8. . 095. 3 (088.8) Дата опубликования описания 07-1031 (72) Автор изобретения

С.Н.Харченко украиHGKBH ордена Трудового Красного сельскохозяйственная академия (71) Заявитель (54 ) СРЕДА ДЛЯ EblCTPOA ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ

ТОКСИНООБРАЗУЮЩИХ ГРИБОВ

Изобретение относится к области микотоксикологии и может быть использовано при разработке способов определения пораженности кормов и продуктов питания определенными видами токсинообразующих грибов - возбудителей алиментарных микотоксикозов человека и сельскохозяйственных живот- .

)уах, а также для ранней и быстрой идентификации образуемых микромицетами токсинов.

Предлагаемая среда может найти применение не только для выявления грибов, продуцирующих микотоксин коевую кислоту, но и для дифференциа- 35 ции этой группы грибов,от сопутст- . вующих микроорганизмов, населяющих грубые корма и другие пищевые продуклые известна среда для быстрой иден- 20 ти4икации и определения количества

А.flarus и родственных организмов следующего состава,В: 1,5 триптона, 1,0.дрожжевого экстракта, 0,05 цитрата железа 1,5 агара., на которой по ярко желто-оранжевой пигментации колоний и среды отделяют афлаток.синобраэующие штаммы грибов от беспигментных сопутствующих,микроорганизмов (11. 30

Однако образуемая по данной среде устойчивая характерная для токсических штаммов аспергиллов желто оранжевая пигментация не всегда является диагностическим признаком.

Подобную пигментацию колоний образу- ют во время роста на ней виды A

phureus, А.sclегоtiorum, А.thomlf, которые как продуценты афлатоксинов не известны.

Кроме того, естественный компонент в данной среде — дрожжевой экстракт может менять свой химический состав в зависимости от способа приготовления, условий и сроков хранения и т.д. Поэтому рассматриваемую среду следует отнести в группу полусинтетических сред неопределенного состава, для которых присущ один общий недостаток: на них повторность одинаковых условий для культивирования грибов часто бывает трудно достигаема.

Известна также среда Чапека, имеющая следующий состав, г/л: глюкоза или сахароза 20-30; МайОк 2"3, КН Р04 0,8-1,2, MgSOg 7Н О 0,5-0,7, КС I 0,5-0,8 FeS0 0,01-0,02; дистиллированная вода до 1 л, агарагар 15-20 (2).

870429

0 8-1,2

0 5-0,7

0,5"-0,8

Это одна из часто применяемых синтетических сред для выращивания микроскопических грибов. Однако ввиду ее универсальности она не может быть использована для дифференциации отдельных видов или групп микромицетов, в том числе продуцентов микотоксинов.

Целью изобретения является быстрая дифференциация токсинообраэующих. грибов, продуцирующих коевую кислоту.

Поставленная цель достигается тем, что в среде Чапека увеличено содержание углеводов, а также дополнительно введены лимонная кислота и хлорное железо при следующем соотношении компонентов, г/л:

Сахароза или глюкоза 50,0-100,0

Натрий азотнокислый 2,0-3,0

Калий фосфорнокислый одноэамещенный

Магний сернокислый

Калий хлористый

Железо эернокислое закисное 0,01-0,02

Железо хлорное 1,2-1,8

Лимонная кислота 0,3-1,0

Агар-агар 15-20

Вода дистиллированная До 1 л

В процессе приготовления среды компоненты растворяют в такой последовательности: первыми растворяют в дистиллированной воде минеральные соли (NaNOg, КН Р04, HgSO4 7Н О, КС1) затем лимонную кислоту, FeSO и

FeС1g, последней — сахарозу и глюкозу.

Для лучшего растворения компонентов среду подогревают до 50-бО С и периодически перемешивают круговыми движениями в колбе или стеклянной палочкой. После полного растворения всех компонентов прозрачную желтосоломенного цвета среду агариэуют.

Высокое содержание углеводов при сравнительно низком уровне азота в среде обеспечивает оптимальные условия для образования грибами коевой кислоты.

Лимонная кислота обуславливает кислую реакцию среды (2,5-3,0), необходимую для превращения микромицетами сахара в коевую кислоту, а также служит одновременно консервантом, который обеспечивает рост на данном субстрате грибов-кислотообразователей, в частности видов аспергиллов, для многих штаммов которых лимонная кислота часто является естественным продуктом метаболизма и препятствует при этом развитию на нем других видов гифальных грибов,,дрожжей, бактериальной .флоры и актиномицетов. Поэтому предлагаемую среду можно использовать в работе, соблюдая условия стерильности посева исследуемого материала (а также разлив среды в сте5

ЗО

У

4Q

55 бО

65 ририльную посуду), не подвергая ее специальной термической стерилизации.

Дифференциация токсинообраэующих грибов-продуцентов коевой кислоты при помощи разработанной среды основана на использовании характерной качественной реакции ее с хлорным железом. Образуемая при взаимодействии коевой кислоты с 0,1%-ным раствором хлорного железа красная окраска крайне чувствительна и позволяет.обнаружить ее в субстрате при разведении 1:2000000 (5-5,5 мкг/мл)

Вишнево-красная пигментация среды вблизи колоний грибов, растущих на среде с индикатором, означает присутствие в субстрате коевой кисло-. ты.

Для сравнения высеваемости видов аспергиллов и дифференциации среди них продуцентов коевой кислоты на предлагаемой среде и среде-прототипе производят на них посев микробных ассоциаций, содержащий, помимо исследуемых видов рода А.spergollus, другие виды грибов, а также актиномицеты.

Дифференциацию аспергиллов-продуцентов коевой кислоты производят по вишнево-красной пигментации колоний и субстрата — при высеве ассоциаций михробов на предлагаемую среду,. или общепринятыми методами, включающими выделение чистых культур грибов-продуцентов, культивирование их на жидких средах с последующим колориметрическим определением содержания коевой кислоты в культуральных жидкостях, грибов и проверкой токсичности ее в опытах на лабораторных животных — при высеве ассоциаций микроорганизмов на среду-прототип.я.

На среде-прототипе отдельные виды аспергиллов либо вообще не выделяются, либо из-за отсутствия оптимальных условий не выявляют способности продуцировать коевую кислоту.

Появление ярко- или темно-красных зон (размер зоны и интенсивность ее окраски зависит от концентрации в субстрате коевой кислоты) может быть отмечено вблизи колоний, едва заметных невооруженным глазом, и почти всегда у колоний диаметром 2-10 см.

Это преимущество предлагаемой среды дает возможность быстро произвести дифференциацию токсинообразующих микомицетов по признаку (образуют они или не образуют токсин коевую кислоту уже через 24-48 ч после инокуляции среды исследуемым материалом, а не в течение 7-10 сут, как это требует общепринятый прием анализа неблагополучных кормов при высеве их на общеприменяемые среды).

Предлагаемая среда определенного состава элективна для роста аспергиллов, в том числе потенциальных ток870429 в следую50-100

2-3

0 8-1,2

0 5-0,8

0 5-0,7

0,01-0,02

1,ã-1,8

0,3-180

15-20 формула изобретения

До1л

Составитель М.Мирзаев

Техред М.Рейвес Корректор Г.Назарова

Редактор Н.Потапова

Заказ 8675/52 Тираж 531 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП ."Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 синообраэователей — А. f I avus, что дает возможность испольэовать ее для дифференциации этой группы грибов от сопутствующих микроорганизмов, населяющих корма и другие субстраты, а также характеризуется свойством 5 быстро выявлять среди микомнцетов виды и штамжа продуцирующнх микоток-.. син — коевую кислоту.

Среда для быстрой дифференциации токсинообразукщих грибов, включающая сахароэу или глюкозу, натрий азотнокислый, калий фосфорнокнслый одноэамещенный, калий хлористый, магний сернокислый, железо сернокислое эакисное, агар-агар и воду, о т— л и ч а ю щ а я с я тем, что, с целью повышения элективности для токсинообразующих грибов, она дополнительно содержит лимонную кислоту и хлорное железо, причем компоненты содержатся s среде щем соотношении, г/л:

Сахароза илн глюкоза

Натрий азотнокислый

Калий фосфорнокислый однозамещенный

Калий хлорнстый

Магний сернокислый железо сернокислое эакисное

Мелево хлорное

Кислота лимонная

Агар-агар

Вода дистиллирован-. ная источники информаци», принятые во внимание при экспертизе с

1. РуководСтво для изучения почвенных микроорганизмов и их метаболитов. N., изд.МГУ, 1967.

2. Спесйвцева Н.A., Хмелевский В.Н

Санитария кормов М, "Колос", 1975, с.254-29б (прототип).