Способ получения сухого материала васillus тнuringiеnsis

 

()923491

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советсимх

Соцмапмстмчеснмх

Ресяубпмн (61) Дополнительное к авт. свид-sy— (22)Заявлено 11.12.78 (21) 2697229/30-15 с присоединением заявки М— (23)Приоритет (ы)м. Кл .

A 01 N 63/00

РкударстваиныМ квинтет

СССР (53} УДК 573.851.

5 (088. 8) ао делам нзвбрвтеннй н отерытнй

Опубликовано 30.04.82. Бюллетень М 16

Дата опубликования описания 30 04 ° 82 (72) Авторы изобретения

s

Г.М.Иванов, В.В.Гулий и А.И.Михалев (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОГО МАТЕРИАЛА

BACILLUS ППЖ1ХС?ЕИ$1$

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения посевного материала и поддержания энтомопатогенных микроорганизмов.

Известен благоприятный субстрат для поддержания BaciIIus thuringiensis которым является растертые тру. пики чувствительных к этим бактериям насекомых, а именно гусениц тутового шелкопряда fl) .

Известен также способ получения сухого материала и поддержания энтомопатогенных бактерий Вас. thuringienэЫ, заключающийся в заряжении бактериями чувствительных к ним насекомых, 15 например гусениц сибирского шелкопряда. Погибших гусениц высушивают в эксикаторе над хлористым кальцием при комнатной температуре в течение

М

l0-12 суток, затем их растирают в порошок, в результате получают сухой материал энтомопатогенных микроорганизмов. Поддержание их заключается в слудующем: иэ полученного сухого материала готовят суспенэию, затем

1 мл этой суспензии переносят в чашку Петри с расплавленным мясо-пептонным агаром и перемешивают, чашки с посевом инкубируют в термостате в течение 4.-6 суток. Затем из нескольких колоний, характерных для

Вас. thurinpiensis var dendroIemus производят посев на скошенный мясопептонный агар в пробирках, инкубируют в термостате в течение 4-6 суток, полученные культуры типируют, определяют чистоту культуры, выбраковывают .культуры, имеющие контаминанты, отбрасывают культуры других вариантов Вас. thuringiensis, после чего ro— товят суспензию чистой культуры, полученной суспензией заражают гусениц сибирского шелкопряда (21.

Недостатком извест ного способа является то, что,насекомые всегда содержат в пищеварительном тракте и на поверхности тела разнообразные

92349

50 микроорганизмы - контаминанты и другие варианты Вас thuringiensiq, поэтому при выделении культур из сухого материала, а также при заражении гусениц, необходимо осуществлять посев культур и их типирование, производить очистку культур от контаминантов. Способ весьма трудоемкий и продолжительный, на выполнение его уходит 440-584 час. Кроме того, для 10 осуществления известного способа необходимо использовать мясо-пептонный агар. При определении результатов этот способ несет в себе элементы

I субъективности и требует высокой 15 квалификации исполнителя.

Цель изобретения - исключение из

- сухого материала микроорганизмов— контаминантов, а также случайных вариантов ВаС. thuringienSiS, сокра- 0 щение и упрощение числа операций, уменьшение трудоемкости и снижение требований к опытности и квалифика" ции исполнителя.

Поставленная цель достигается тем, 25 что операцию заражения гусениц осуществляют с использованием стерильного корма, который стерилизуют в автоклаве, затем смешивают с суспензией энтомопатогенных микроорганизмов и кор- З0 мят насекомых-гнотобионтов или заражают их погружением на 3-5 с в суспензию.

Пример 1. Ампулу с лиофильно35 высушенной дрожжеполисахаридной средой с культурой Вас.thuringiensis

GaIIeriae (серотип У) вскрывают, наливают в нее пипеткой 1 мл стерильной воды и взбалтывают в результате полу1 40 чают суспензию; которую вливают в стерильную ступку, куда помещают

3 г стерильного корма для гусениц

QaIIeria meIIoneIIа, затем суспензию вместе с кормом растирают и переносят

45 в стерильную чашку Петри, куда помещают 15 гусениц - гнотобионтов

CaIIeria meIIoneIIа У-У1 возрастов и выдерживают в термостате при 2830 С в течение 72 ч. Погибших гусениц переносят в стерильную колбу емкостью 50 мл с ватно-марлевой пробкой, колбу с трупами гусениц помещают в термостат и выдерживают

8 суток при 29-30 С, при этом ведут контроль спорообразования, для этого из трупов гусениц готовят мазок, фиксируют на пламени спиртовки, . окрашивают фуксином и микроскопиру1 4 ют. Когда около 96 клеток завершают спорообразование в колбу с трупами гусениц заливают 30 мл стирильной воды и стеклянной палочкой трупы гемогенизируют, полученный гемогенат трупов стерильной пипеткой разливают по 2 мл в стерильные ампулы емкостью

5 мл, помещают в камеру лиофилизатора, сушат при 1 10 Т и минус 18 С

-3 о в течение 60 ч, затем из ампул удаляют воздух с помощью вакуум-насоса и при 1 10 Т и ампулы запаивают пламенем горелки.

Контроль на присутствие контаминантов и случайных вариантов Вас.thuringiensis осуществляют следующим образом.

Ампулу с лиофильновысушенным трупным материалом вскрывают, наливают в нее пипеткой 2 мл стерильной воды, содержимое суспендируют и производят посев на скошенный мясо-пептонный агар в пробирках и чашках Петри, посевы инкубируют в течение 72 ч при

32 С, затем производят сравнение выросших колоний визуально и делают из

15 колоний мазки, фиксируют над пла-. менем спиртовки, окрашивают и микроскопируют, готовят суспензию культур со скошенного агара в пробирках и осуществляют сероагглютинацию с сыворотками серотипов Вас. thuringiensis, в результате контаминанты в сухом материале не обнаруживают, суспензии культур со скошенного агара агглютинируют с сывороткой серотипа У и не агглютинируют с сыворотками других серотипов Вас. thuz-ingiensis, следовательно случайные варианты Вас, thuringiensis в сухом материале отсутствуют.

Пример 2. Ампулу с сухим материалом Вас thuringiensis var CiaIIeriae, полученным в примере 1, заливают 2 мл стерильной воды, содержимое ампулы суспендируют, после чего ее выливают в стерильную ступку, куда помещают 5 г стерильного корма, все перемешивают и растирают стерильным пестиком, инфицированный корм раскладывают в две чашки Петри, куда помещают по 15 гусениц-гнотобионтов У-У1 возрастов. Далее операцию продолжают, как в примере 1 до получения сухого материала. В результате этого эксперимента контаминанты в сухом материала не обнаруживают, суспензии культур со скошенного агара не агглютинируют с сыворотками„ других сероСоставитель М.Иирзаев

Редактор И.Тыкей Техред А. Бабинец l îððåêòîð Г.Решетник

Тираж 699 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР. по делам изобретений и открытий .

113035, Москва, К-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 2645/6

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 9234 типов Вас thuringiensis, а аглютинируют с сывороткой серотипа У.

Пример 3. С агаровой культуры Вас thuringiensis var GaIIeriae делают смыв стерильной водой, из смы- 5 ва приготовляют суспензию, содержащую 32 мпн. спор в 1 мл, после чего 3 мл суспензии наливают в стерильную ступку, заФем гусениц-гнотобионтов GaIIeria meIIoneIIa 1У-У возрас- 1О тов стерильным пинцетом на 3-5 с окунают в эту суспензию и по 10-15 особей помещают в четыре стерильные чашки Петри со стерильным кормом. Чашки с содержимым термостатируют при

28-30 С в течение 72 ч. Последующие операции осуществляют как в примере

1 до получения сухого материала. После этого контаминантов и случайных вариантов Вас. thuringiensis в су- о хом материале не обнаруживают

91 6

Формула изобретения

Способ получения сухого материала

BaciIIus thuringiensis включающий, приготовление суспензии бактерий, заражение насекомых и высушивание погибших насекомых, о т л и ч à юшийся тем, что, с целью исключения попадания в сухой материал посторонних микроорганизмов, а также снижения трудоемкости, для заражения используют безмикробных гусениц аИег1а neIIoneIIa.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Африкян Э.К. Энтомопатогенные бактерии и их значение. Изд.АН Армян ской ССР, Ереван, 1973, с. 238.

2. Талалаев Е.В. К методике cox" ранения вирулентности споровых бактерий. "Микробиология", 1969, т. 3S, 6 (прототип).