Способ получения делипилизированной сыворотки крови животных

 

(>i!928995

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАН ИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К IlATEHTY (61) Дополнительный н патенту (22) Заявлено 03.06.80(21) 2932151/28-13 (23) Приоритет - (32) 04.06. 79 (51) М. Кл.

A 61 К 35/16 (31) 045182

Йсударстееииый комитет (33) C!1)A

cccs

Опубликовано 15.05.82.Бюллетень ¹ )8 до делам иэобретеиий и открытий (53) ?.Й1< 615 ° 739.6 (088.8) Дата опубликования описания 15.05.82 иностранцы

Энглис Рей СРриггс и Джек Миттетн-Хрис„., (С, !A)

1 (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма"Е.И. Дюпон де Немур энд Компани".(CUA ) (71) Заявитель (Б4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕЛИПИЛИЗИРОБАННОН

СЫВОРОТКИ КРОВИ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии.

Известен способ получения делипилизированной сыворотки крови животных путем смешивания сыворотки с к анионообменными смолами (1 ).

Однако известный- способ не обеспечивает высокой степени делипилизации и отделения электролитов от сыворотки. 10

Целью изобретения является повышение степени делипилизации и отделение электролитов от сыворотки.

Эта цель достигается тем, что при осуществлении спосооа получения де- И липилизированной сыворотки крови животных путем смешивания сыворотки с анионообменными смолами, смешивают сыворотку крови с анионо-катионообменными смолами, доводят рН до 4,95, 5, отделяют надосадочную жидкость, доводят рН надосадочной жидкости до 3,0-5, О, выдерживают надосадочную жидкость до снижения ферментативной активности до 1-3 МЕ/л. 25

При этом рН надосадочной жидкости доводят до 6, 7-7, 6 путем добавления 2-амино-2-оксиметил-1,3-пропандиола.

Способ осуществляют следующим образом.

Цельную кровь, взятую от донора, помещают в пробирку и выдерживают в ней без встряхивания. Через несколько минут происходит свертывание (коагуляция ) крови и образование кровяного сгустка.

Затем эту кровь подвергают центрифугированию с целью уплотнения об" разовавшегося кровяного сгустка и отжима из него жидкой сыворотки, но можно оставить образец на несколько часов в обычных условиях, в течение которого сгусток медленно сжимается, уплотняется и выдавливает из себя сыворотку, которую затем отделяют от сгустка декантацией.

Для получения делипилизированной сыворотки контролируют и регулируют концентрацию катионов или анионов, 928995 4

55 присутствующих в сыворотке, которую предстоит обработать. Для полного об мена анионов и катионов необходимо использовать достаточное количество смешанной ионообменйой смолы, а также контролируют рН. Величина рН соответствует изоэлектрической точке липопротеинов, обычне присутствующих в сыворотке..

Для достижения снижения величины рН, вызывающего осаждение липопротеинов из сыворотки одновременно с ионным обменом, необходимо использовать избыток катионообменной смолы, т.е. необходимо, чтобы в используемую смешанную анионо- катионообмен-, ную смолу был введен избыток катионобменной смолы. Это избыточное коли" чество катионообменной смолы определяют путем титрования данного объема сыворотки, например 25 мл, разбавленной (1,00 ) соляной кислотой до рН 5, О. Объем кислоты, пошедшей на титрование, обозначают как титр сыворотки и, зная этот титр, используют соответствующее количество катионообменной смолы.

Для получения делипилизированной, сыворотки используют замороженную человеческую сыворотку. Ей дают оттаять. при 32 - 37 С, используя водяную баню. Оттаявшую сыворотку осматривают, нет ли в,ней,видимых признаков липемии или гемолиза, т.е. сыворотка должна быть прозрачной и практически бесцветной. Если сыворотка визуально выглядит красной или розовой по цвету или мутной на просвет, то эта сыворотка непригодна для использования. Кроме того, сыворотка не должна содержать патогенных мик роорганизмов.

При смешении ионообменной смолы и сыворотки осуществляют постоянный

KorlTpoRb за изменениями величины рН.

В первые несколько минут после прибавления смолы к сыворотке величина рН увеличивается по сравнению с первоначальной до 9,0 - 10,3. Для снижения рН и удаления ионов из сыворотки обычно используют .избыток смешанной ионообменной смолы с тем, чтобы компенсировать некоторое уменьшение эффективности смолы, вызванное отложением липопротеинового осадка на поверхности гранул смолы в процессе преципитации липопронтеинов.

При необходимости к сыворотке добавляют в 1,45 Й О, 15 раз больше по

15 го

Зо

40 сравнению с теоретически вычисленным количество смешанной ионообменной смолы.

После того, как рН достигает

5 2 + 0 3 (это обычно занимает 815 мин); перемешивание смеси ионообменной смолы и сыворотки прекращают и надосадочную сыворотку (супернатант) отделяют от смолы и выпавших в осадок липопротеинов. Отделение супернатанта от осадка осуществляют любым известным способом, таким как фильтрование, декантация отсасывание надосадочной сыворотки.

Величину рН сыворотки, отделенной от осадка, доводят затем до 4,0 + 1,0 добавлением соляной кислоты, чтобы обеспечить низкую ферментативную активность в сыворотке. Желательно, чтобы активность фермента креатинкиназы (КК ) не превышало 3 ИЕ/л.

Для этого сыворотку выдерживают при рН 4, 0 + 0, 2 в течение длительного времени, чтобы обеспечить полное завершение денатурации. Этот процесс контролируют, периодически проводя анализ сыворотки для определения активности КК. Эту сыворотку можно оставить на ночь,на хранение при конечном значении рН, если хранить ее о при 4 С, рН сыворотки доводят до конечного значения, равного 7,3 « 0,3, путем добавления подходящего буферного раствора, такого как 2-амино2-оксиметил-1,3-пропандиола.

Эту делипилизированную сыворотку можно хранить длительное время в замороженном состоянии или при 4 С в течение 48 ч (без добавления микробных ингибиторов).

Эту сыворотку можно использовать для клинических анализов.

П р и м е .р. Приготовление смешанной анионо-катионообменной смолы.

Универсальную высокоемкую сильнокислотную катионообменную смолу

"Дуолит б PC-301" и высокопористую сильноосновную анионообменную смолу

"Дуолит GPC-316" смешивают между собой, полученную смесь тщательно перемешивают с целью гомогенизации в смесителе до получения гомогенной смеси, которую можно хранить в герметично закрытых сосудах или контейнерах для предотвращения изменения воздушно-сухого веса и нежела тельного взаимодействия с атмосферной двуокисью углерода.

928995

Формула изобретения эц 1, Способ получения делипилизированной сыворотки крови животных пу" тем смешивания сыворотки с анионообменными смолами, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения степени делипилизации и отделения электролитов от сыворотки, смешивают сыворотку крови с анионо"катионо обменными смолами, доводя рН до 4,95,5, отделяют надосадочную жидкость, доводят рН надосадочной жидкости до

3,0-5,0, выдерживают надосадочную жидкость до снижения ферментативной активности до 1-3 ИЕ/л.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю45 ц и и с я тем, что рН надосадочной жидкости доводят до 6, 7-7,6 путем добавления 2-амино-2-оксиметил-1,3пропандиола.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. А.Noma. Simultaiaeoas Oetermi

nation of Serum Cholestегоl in Hiqh

and Lou Den s i ty 1poprote in s. - "С l i-u i ca l Chem, 1978, v.. N 24, р. 1504.

50

ВНИИПИ Заказ 3289/78 Тираж 717 Подписное

После этого приготавливают сыворотку крови человека.

Выход делипилизированной сыворотки при использовании настоящего способа составляет примерно 80 - 854 от исходного ее обьема. Поэтому для получения желаемого конечного количества сыворотки, где исходная сыворотка хранится в замороженном состоянии, берут приблизительно в 1,25 раза 1 больше количество исходной сыворотки. Эту сыворотку быстро размораживают, выдерживая на водяной бане

О при 32 - 37 С. После осмотра оттаявшей сыворотки на предмет выяснения, нет ли признаков каких-либо изменений, таких как окрашивание (гемолиз7 или помутнение (липемия), сыворотку помещают в полиэтиленовую емкость достаточного размера. 2

Получение делипилиэированной сыворотки.

К 32 л оттаявшей сыворотки, рН которой 7,5 — 8,0 и не обнаруживаю- щей никаких признаков окрашивания в 2 красный или розовый цвет и никаких признаков помутнения, прибавляют

8,96 кг смешанной ионообменной смолы, приготовленной на предыдущей стадии, одновременно быстро перемешивая смесь. Изменение рН прослеживают с помощью электродов, помещен.ных в реакционную. смесь. После того, как рН достигает 10,1 (через 1,5 мин после начала реакции) оно начинает. медленно падать и достигает 5, 15 (по истечение 12 мин}. По истечении этого времени перемешивание смеси прекращают и дают возможность смоле и выпавшему осадку липопротеинов отстояться, после чего надосадочную делипилизированную сыворотку удаляют отсасыванием. рН полученной делипилизированной сыворотки доводят до 7,3 добавлением 2-амино-2-оксиметил-1,3-пропандиола. Так как порошкообраэный амин растворяется в сыворотке довольно медленно, то при его прибавлении и растворении необходимо перемешивание смеси.

Делипилизированную сыворотку можно хранить при 4 С в течение 48 ч, если возникает необходимость хранить ее более длительное время, то сыворотку замораживают.

Получение контрольного материала осуществляют путем добавления к 5 л полученной сыворотки. 1250 ИЕ очищенного СКИВ-изоэнэима при комнатной температуре.

Полученный таким образом контрольный материал, обладающий определенной ферментативной активностью, может быть лиофилизирован для сохранеО. ния этой ферментативной активности и может храниться в виде лиофилизированного препарата до тея пор, пока он не потребуется.

В этом случае его используют в виде восстановленного в прежнем виде раствора в качестве контрольного материала для клинического анализа.

Восстановленный после, лиофилизации в виде раствора материал может быть

g разбавлен до любой желаемой концентрации дилипилизированной сывороткой, полученной предложенным способом.

Предложенный способ позволяет повысить степень делипилизации и отделение электролитов от сыворотки.

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4