Способ выделения метилазы есо ri из еsснеriснiа coli

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

«»929705 (63) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 1109,80 (21 } 2985387/28-13 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

Опубликовано 2305,82. Бюллетень ¹ 19

151234.Кл з

С 12 N 1/02

Государственный комитет

СССР

00 делам изобретений и открытий

РЗ)УДК 577.15 (088.8) Дата опубликования описания 2305,82 (72) Авторы изобретения

И.Л. Глухов, Фодор Иштван и А.A Бае

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов AH СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЦЦЕЛЕНИЯ МЕТИЛАЗЫ ECO RI

ИЗ ESCHERICFIIA CO LI

Изобретение относится к способам выделения ферментов, а именно к способам выделения высокоочищенных ДНК метилаз, которые находят применение в экспериментах по изучению структуры и функции ДНК и в генной инженерии.

Известно несколько методов выделения метилазы Есо R I.

Они основаны на Фракционировании белков с помощью сульфата стрептомицина, сульфата аммония, ионообменной хроматографии и позволяют получать высокоочищенные препараты (1) .

Однако эти методы трудоемки, длительны и дают низкий выход фермента.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ выделения метилазы Есо

RI из Escherichia col i, предусматривающий дезинтеграцию, Фракционирование сульфатом стрептомицина, концентрирование сульфатом аммония и диализ.

В этом способе в качестве источника фермента используют клетки

Escherichia coli RI 13. После дезин- 25 теграции клеток и последующего центрифугирования белки неочищенного экстракта фракционируют сульфатом стрептомицина, осадки экстрагируют растворами различных концентраций ЗО сульфат а аммони я, концен три руют сульфатом аммони я, осадок растворяют в буферном растворе.и диалиэуют, диализат хроматографируют на колонках с фосфоцеллюлозой P-l l, гидроксилаппатитом, фракции, содержащие метилазу Есо RI диализуют, концентрируют на колонке с гидроксилаппатитом и подвергают гельфильтрации на колонке с Bio-Gel-0,5 m препарат фермента концентрируют диализом против раствора с 50%-ным глицерином. Выход

16Ъ, удельная активность 7,500-.

8,000 ед/мг белка (2).

Недостатками этого способа явля ется низкий выход целевого продукта и наличие большого количества трудоемких стадий.

Цель — увеличение выхода целевого продукта и ускорение процесса выделения.

Указанная цель достигается тем, что в способе выделения метилазы

Eco RI из Escherichia coIi, предусматривающем дезинтеграцию, фракционированиЕ сульфатом стрептомйцина, концентрирование сульфатом аммония и диализ, после диализа проводят фракционирование на колонках с полиэтилен929705

Формула и зоб ретени я

Составитель В.Муронец

Техред 3. Фанта Корректор А.Дзятко

Редактор Н.Гунько

Эаказ 3415/35 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

ФИлиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная,4 имин-агарозой, гепарин-агарозой и фос-. фоцеллюлозой P-l l .

За единицу активности принимают количество Фермента, необходимого для переноса 1 pmol метильной группы метиладенозинметионина на ДНК в тече- 5 ние 1 мин, при 37 С.

Препарат фермента не содержит эк.зонуклеаз, на что указывает полное сохранение дезоксинуклеотидной последовательности ДНК и суперспиральной 1р формы плазмидной ДНК при длительной инкубации (10 ч} избыточных количеств фермента (10-20 ед.) с фрагментами

ДНК (1 мкг} и плазмидной ДНК (pBR322) в условиях, способствующих действию нуклеаз . (в присутствии ионов Мф ) °

Это позволяет использовать его в эк-, . . спериментах по молекулярно-биологическому к он с труиров анию рекомбин атных

ДНК in vitro.

Пример. Escherichia coli g К

29 выращивают до -титра 6-7х10 бактериальных тел в мл при 37ОС с интенсивной .аэрацией на среде следующего состава, г/л: пеп тон-10; дрожжевой экстракт 5; NaC1 10; глюкоза 2 ° Клетки отделяют центрифугированием. Все дальнейшие операции проводят на холоду от0до 5С).

Биомассу (10 r) дезинтегрируют в буфере A (20 мМ калий фосфат, 7 мМ 30

2-меркаптоэтанол, 1 мМ ЕДТА, рН 7,0) для получения белкового экстракта, а клеточные стенки отделяют центрифугированием. Осадок отбрасывают ° Супернатант фракционируют. сульфатом 35 стрептомицина и концентрируют сульфа . том аммония (70% насыщения) . Осадок растворяют в буфере В (20 MR калий фосфат, 20 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,5 мМ ЕДТА, 10% глицерин, рН 7,4) с 41

0,2 М КС1 и диализуют против этого же ,буферного раствора (6 ч) . Диализат наносят на колонку с полиэтилениминагарозой (5 мя) (полиэтиленимин, ковалентно пришитый к агарозе) промывают буфером В с 0,2 М КС1 и элюируют

0,5 М КСl. Элюат разбавляют в .2,5 ра за буфером В и пропускают через колонку с геп арин- а гароз ой (2 мл) гепарин ,ковалентно пришит к агарозе. Фракции, содержащие не сорбировавшийся на смо- 5О лу белок наносят на колонку с фосфоцеллюлозой P-11 (0,5 мп), промывают буфером B с 0,2 м КС1 и элюируют

0,45 м КС1. Элюат, содержащий метилазу Есо RI диализуют против 50% глицерина в буферном растворе (20 ьИ калий фосфат, 0,25 N КС1, 1 мМ ЕДТА, 2,5 мМ дитиотреитол) .

Выход целевого продукта 30-35%, удельная активность 8000 ед/мг белка.

Таким образом, предлагаемый способ очистки позволяет получить препарат метилазы Есо RI с выходом, превышающим в два раза выход конечного препарата по сравнению с описанными способами очистки при той же удельной активности (7500-8000 ед/мг белка) . Пре- парат фермента свободен от экзонуклеаз, эндонукйеаз, что позволяет его использовать в экспериментах по генной инженерии ° Сокращено число стадий и время выделения благодаря исключению из процесса очистки стадий экстракции раствором сульфата аммония, концентрирования на колонке с гидроксилаппатитом, а также замене стандартных методов хроматографирования методами фракционирования на новых более избирательных сорбентах, позволяющих исключить стадии диализа в процессе фракционирования белков на колонках.

Способ может быть использован для получения метилазы Есо RX, необходимой для экспериментов по генной инженерии.

Способ выделения метилазы Eco RI из Escherichia col i, предусматривающий дезинтеграцию, фракциониров ание сульфатом стрептомицин а, концентриров ание сульфатом аммония и диализ, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода фермента и ускорения процесса выцеления, после диализа проводят Фракционирование на колонках с полизтиленимин-агарозой, гепаринагарозой и фосфоцеллюлозой P-11 ..

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Green P. J. et al. Restriction

and 14odification of. à Self — Complementary Octanuc1eatide Containing the

Есо RI Substrate. — The Journal of Mo- .

lecular Biology, 1973, 99,237-261.

2. Rubin R.A. Modrich P. Eco RI

Hethylase. Physical and Catalytic Properties of the Homogenous engyme.—

The Journal of Biological Chemistry, 1977, 252, 9 20, 7265-7272.