Способ изготовления ферментного электрода

 

>958950

ОП ИСАНИЕ

ИЗЬ6РЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 05.02.81 (21) 3269281/18-25 (51) M. Кл з с присоединением заявки №вЂ”

G 01 N 27/30

Гееудлретееннмй кемнтет (23) Приоритет—

СССР

Опубликовано 15.09.82. Бюллетень № 34

Дата опубликования описания 25.09.82 (53) УДК 543.257 (088.8) лв делам нзеаретеннй н еткрмтий

К. А. Макаров, Я. Д. Зытнер, Л. С. Тихонова, А

О. А. Белозерова и А. М. Дедю (72) Авторы изобретения

1-й Ленинградский медицинский институт им. ак и Всесоюзный научно-исследовательский констру медицинской лабораторной техн (71) Заявители (54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ЭЛЕКТРОДА

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к способам получения ферментных кислородных электродов, применяемых для измерения концентрации глюкозы в биологических средах, и может быть использовано в химической и медицинской промышленностях.

Практически все известные гель-ферментные электроды приготовлены иммобилизацией ферментов в геле полиакриламида. Различия заключаются лишь в том, какой метод полимеризации (химический или фотоинициируемый) используется при приготовлении гель-фермента.

Преимущества полиакриламидных гелей состоят в том, что образующийся полимер легко гранулировать и в зависимости от условий реакции можно получать гели различной пористости.

Известен способ получения ферментного электрода путем захвата фермента между поверхностью электрода и диализной пленкой, задерживающей фермент для молекул субстрата и продукта (1).

Недостатком способа, является очень быстрая потеря активности электрода при эксплуатации и хранении в буферном растворе из-за диффузии фермента из геля в раствор и требуется дополнительная стадия закрепления на поверхности электрода полиакриламидного геля, содержащего фермент.

Наиболее близким техническим решением к изобретению является способ получения ферментного электрода, заключающийся в растворении в воде акриламида, N,N -метилен-бис-акриламида и фермента и проведе1о ния процесса полимеризации (2).

Известный способ осуществляется следующим образом. Растворяют в воде акриламид, N,N --бисметиленакриламид и фермент.

В присутствии катализатора проводят процесс полимеризации. Процесс ведут при охлаждении в течение 1 ч. Затем полученный. ,полиакриламидный гель, содержащий фермент, закрепляют на поверхности электрода различными нрсителями и пленками (целлофаном, не лоновой сеткой, тефлоновой тесьмой и т.д.).

Преимуществом способа является то, что фермент относительно прочно удерживается в структуре геля. Однако при многократном

958950

Фермент

Известный способ

0,063

0,025

0,090

Свободный гель

Целлофан

Нитроцеллюлоза

Нейлон

5,5

2.0

11

0,050

0,140 применении ферментного электрода происходит уменьшение его стабильности.

Однако данный способ трудоемкий и сложный из-за большой продолжительности, необходимости применения катализаторов, которые в ряде случаев частично ингибируют фермент; необходимости охлаждения раствора, так как выделяющееся тепло при химической полимеризации приводит к инактивации фермента; необходимости операции закрепления полиакриламидного геля на поверхности электрода. Кроме того, толщина образуемого полиакриламидного геля, содержащего фермент, не является стабильной, несмотря на одинаковость технологических операций.

Целью изобретения является упрощение способа.

Поставленная цель достигается за счет того, что, согласно способу, заключающемуся в растворении в воде акриламида, N,N -бис-метиленакриламида и фермента и проведении процесса полимеризации с последующим нанесением геля на поверхность электрода, полимеризацию проводят одновременно электрохимически путем наложения на электрод потенциала в интервале от — 1,1 до — 1,5 В в течение 1 — 5 мин.

Одновременное проведение процессов полимеризации акриламида и N,N -бис-метилен акриламида в водном растворе фермента и нанесения образуемого полиакриламидного геля, содержащего фермент, на поверхность электрода, погруженного в водный раствор, значительно упрощает способ.

Проведение процесса электрохимической полимеризации в интервале потенциалов от — 1,1 до — 1,5 В (относительно хлорсереб ряного электрода) связано с тем, что в этой области потенциалов фермент электрохимически устойчив (не восстанавливается и не теряет своей активности), а также хорошо адсорбируется на электроде. Только в . результате адсорбции фермента на поверхности электрода он включается в полимерную пленку, образующуюся при электрохимической полимеризации. В то же время при

Предлагаемый способ потенциалах более отрицательных, чем-1,5 В происходит электрохимическое восстановление фермента и потеря его активности. В этом случае восстановление фермента на электроде мешает образованию активных центров полимеризации и полимерная пленка не образуется. При потенциалах менее отрицательных, чем — 1,1 В, не происходит образования инициаторов полимеризации и полимерная пленка не получается.

Предлагаемый способ получения ферментного электрода состоит в следующем. Растворяют акриламид, N,N -бис-метиленакрил-! амид и фермент в воде. В полученный раствор опускают металлический электрод. Подают на электрод потенциал в интервале

ts от — 1,1 до — 1,5 В относительно хлорсеребряного электрода, при котором в течение

1 — 5 мин на поверхности электрода в результате электрохимического инициирования процесса полимеризации образуется полиакриламидный гель, содержащий фермент.

Пример. 11риготовляют водный раствор, содержащий, г/л: акриламид 300; N N-бисметиленакриламид 20; хлорид цинка 25;. глюкозооксидаза 0,4. Металлический электрод обезжиривают, промывают водой и погруг жают в данный раствор. Задают электроду катодный потенциал 1,1 В относительно хлорсеребряного электрода и ведут электрохимическую полимеризацию в течение 2мин.

Вспомогательный электрод из алюминия, Температура процесса составляет 20 — 25 С.

З0 Толщина образуемого полиакриламидного геля 20 мкм.

Ферментный электрод, полученный по данному способу, и электрод, полученный по известному способу, исследуют на активз ность спектрофотометрически на приборе

СФ вЂ” 4. Определение активности основывается на измерении УФ-спектра комплекса

KJ (Л = 353 нм), образующегося в результате взаимодействия KJ с Н О (продукта окисления глюкозы под действйем глюкозооксидазы) .

Результаты активности приведены в таблице.

D Относительная погло- актив ность щения фермента,Ъ

958950

Формула изобретения

Составитель И. Рогаль

Редактор М. Дылын . Техред А. Бойкас Корректор Г. Огар

Заказ 6765/59 Тираж 887 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 ! 13035, Москва, ж — 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Исследования показывают, что ферментный электрод, полученный по предлагаемо- . му способу, обладает значительно лучшей активностью, чем по известному способу на самых различных носителях.

Предлагаемый способ получения ферментного электрода по сравнению с известным проще и доступнее, так как процесс использует электрохимические приемы, проводится быстро (в течение 1 — 5 мин) при комнатной температуре, исключая охлаждение и применение катализатора. Отсутствует операция закрепления геля на поверхности электрода, так как при электрохимическом инициировании полимеризации полиакриламидный гель,-содержащий фермент, образуется непосредственно на электроде. l5

Способ позволяет продолжительностью процесса регулировать толщину полиакриламидного геля и содержание в нем фермента.

Активность электродов, полученных согласно предложенному способу, сохраняется при эксплуатации и хранении в течение 2—

3 мес., что позволяет широко и эффективно применять ферментные электроды, полученные по данному способу, для определения различных химических соединений при ферментативном методе анализа.

Способ изготовления ферментного электрода, заключающийся в растворении в воде акриламида, N,N -метилен-бис-акриламида и фермента, проведении процесса полимеризации с последующим нанесением геля на поверхность электрода, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, полимеризацию проводят электрохимически путем наложения на электрод потенциала в интервале — 1,1 — 1,5 В в течение 1 — 5 мин.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Н. Nilsson and other «Determination о1 glucose ura and penicilline using enzymeph-electrode «Biocnim. Biophys. Acta, 320, 529, 1973.

2. J. G. Momtalvo, G. G. Guibault, Anal.

Chem. 41, 1897, 1969 (прототип).