Способ определения аскорбиновой или дегидроаскорбиновой кислоты

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 25.08,78(21) 2652749/23-04 (23) Приоритет — (32) 09.12.77

Союз Совет сних

Социалистических

Республик 971120

4(l э (51) М. Кл.

С 01N 21/78

1оеударотееииый комитет

СССР по делам изобретений и открытий (31) Р2754944.6 (331 ФРГ

Опубликовано 30.10.82Бюллетень № 40

Дата опубликования описания 30.10.82 (53) УДК,543.42.062 (0 88. 8) Иностранцы

Ульферт Денеке, Герхард Михаль и Клаус Б (ФРГ) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Берингер Маннхайм Гмбх" (ФРГ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АСКОРБИНОВОЙ

ИЛИ ДЕГИДРОАСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к способам оттределения аскорбиновой или дегидроаскорбиновой кислоты.

Определение аскорбиновой кислоты имеет большое значение, прежде всего в химии пищевых продуктов, .для оценки качества различных пищевых продуктов, таких, например, как фруктовые соки, свежие овощи, свежемороженные овощи и другие. Часто для прохладительных напитков требуется определенное содержанке витамина С, следовательно, оно должно контролироваться. Аскорбиновую кислоту добавляют в качестве антиокислителя и осветлителя, и поэтому содержание ее также должно определяться. При клиникодиагностических исследованиях обнаружение аскорбиновой кислоты в моче обеспечивает быструю диагностику различных заболеваний. Представляет интерес определение аскорбиновой кислоты в сыворотке для тропических стран, так как в условиях этих стран симптомы авитаминозов (цинги) настолько прикрываются симттто-мами других болезней, что их невозмож- но выделить. Учитывая важность определения аскорбиновой кислоты, разрабо таны различные способы ее определения.

Все сказанное выше справедливо и для дегидроаскорбиновой кислоты, так как аскорбиновая кислота под действием кислорода воздуха легко переходит в дегидроаскорбиновую кислоту. Поэтому в испытуемых продуктах часто присутстр вует смесь аскорбиновой и дегидроаскор. биновой кислот. Поскольку дегидроаскорби.новая кислота оказывает такое же действие, как витамин С, то в большинстве случаев целесообразно определять содер15 жание в испытуемом образце дегидроаскорбата.

Известны различные способы определения аскорбиновой или дегидроаскорбиновой кислоты, например хроматографический

Х способ (1) .

Время, необходтпйое для определения по данному способу, очень велико (не менее 2 ч), причем при подготовке пробы к хроматографии теряется значительное эб количество аскорбата и поэтому количестО, 1-1.,5

3 971120 4 венное определение с помощью указан- обрабатывают избытком гомоцистеина ного способа практически невозможно. при рН 7-8 и содержание дегидроаскорИзвестен также способ, основанный биновой кислоты определяют по разности на окислении аскорбиновой кислоты в между общим содержанием аскорбиновой дегидроаскорбиновую и осаждении послед- 5 и дегидроаскорбиновой кислот и содержаней в виде производного гидразина (2 j . .нием аскорбиновой кислоты.

Данный способ трудоемок и мало спе- Предлагаемый способ осуществляют цифичен, так как все соединения с кетон- в слабокислой среде. При таких значениях ными функциональными группами дают рН большинство мешанших веществ не такую же реакцию, вступает в реакцию или скорость ее

Наиболее близок к предлагаемому спо- настолько замедляется, что практически соб определения аскорбиновой ETIH цегидро- ею можно пренебречь. В такой кислой аскорбиновой кислоты путем обработки среде скорость взаимодействия реактива исследуемой пробы реагентом, содержащим с аскорбиновой кислотой мала, поэтому четвертичную соль тетраэола и щелочной 15 определение аскорбиновой кислоты с ее буферный раствор, с последующим иэ«- помощью практически невозможно. Однако репием интенсивности окраски образую- добавление феназинметосульфата в комбинащегося окрашенного соединения l3 J . ции с детергентом ускоряет эту реакцию.

Недостатком известного способа яв- Неожиданно то, что указанные добавки ляется то, что его проводят в щелочной уО не ускоряют реакцию реактива с мешающисреде и многочисленные вещества оказы- ми веществами. вают мешающее действие. Для установления рН, соответствующеКроме того, укаэанный способ плите- го слабокислой среде, предпочтительно лен. в интервале между 4,0 и 6,0 (особенно цель изобретения — сокращение дл - 25 между 4,8 и 5,3) могут использоваться тельности определения и повышение спе- различные буферные системы, в частности цифичн ости. фосфатно-цитратный буфер, так как в этом

Поставленная цель достигается тем, случае при всех количествах аскорбата что берут две пробы, к первой пробе до- выполняется пропорциональность между бавляют реагент, содержащий фосфатно- уо экстинкцией образующегося окрашенного цитратный буфер, полиэтиленгликолевый вещества и концентрацией. аскорбата. эфир октилфенола, этилендиаминтетрауксус- Предпочтительным детергентом, исную кислоту, 3-(4,5-диметилтиазолил-2)- пользуемым в предлагаемом способе, -2,5-дифенилтетразолбромид, феназинмето- является полиэтиленгликолевый эфир октилсульфат и воду при следующем соотноше- фенола (тритон х 100). нии компонентов, вес. : Скорость реакции увеличивает также

Фосфатно-цитратны и феназинметосульфат (ФМС), обеспечивая буфер 0,5-20 ., количественное протекание реакции. При

Полиэтиленглико- использовании других известных перенослевый эфир октил- чиков электронов такого ускоряющего фенола действия не наблюдается. Концентрация

Этилендиаминтетра- ФМС 0,01 -1 ммоль/л (предпочтительуксусная кислота нее 0,05-0,15 ммоль/л), так как в этом (ЕДТА) 0,0045-0,045 случае не происходит взаимодействия

3-(4,5-Диметил- реактива с соединениями, содержащими тиазолил-2) -2,5-ди- 5 Н-группы, такими как гомоцистеин. фенилтетразолбромид Такие соединения с 6 Н-группами можно (МТТ) 0, 0003,03 добавлять, когда имеющийся в пробе деФеназинметосульфат 0,00025-0,0025 гидроаскорбат необходимо одновременно

Вода До 100 восстанавливать до аскорбата. а к другой параллельной пробе добавляют

5Î

Если в исследуемой пробе находятся укаэанный реагент, содержащий дополни- ионы двухвалентных металлов, склонных тельно аскорбатоксидазу в количестве к образованию хелатов, то могут обра0,0001-0,005 вес.%, вычитают экстинк- зовываться хелаты в результате взаимощцо параллельной пробы из экстинкции действия с получающимся окрашенным

55 первой пробы и рассчитывают содержание . соединением формазина, что может влиять аскорбиновой кислоты, причем в случае на результаты измерений. Хотя образоваопределения дегидроаскорбиновой кислоты ние хелатов в значительной степени попервую исследуемую пробу предварительно давляется вследствие применения ðà

5 9711 но-фосфатного буфера, однако целесообразно добавлять дополнительно к пробе небольшие количества комплексообразоввтелей, таких как этилендиаминтетрауксусная кислота с концентрацией 0,00450,045 вес.%. В особых случаях, в частности при анализе проб с очень высоким содержанием ионов двухвалентных металлов, целесообразны и добавки в больших количествах. 10

При осуществлении предлагаемого способа используют параллельную пробу, дополнительно содержащую аскорбатоксидазу, которая избирательно окисляет содержащийся в параллельной пробе аскорбат. 1S

По окончании реакции окисления параллельную пробу используют как холостую пробу .для определения количества аскорбиновой кислоты, т.е. экстинкцию холостой пробы вычитают из экстинкции исследуемогс 2О раствора и разность используют для расчета количества аскорбиновой кислоты.

Данный вариант осуществления способа повышает его специфичность, в особенности в тех случаях, когда в исследуемом 2S растворе присутствуют вещества, которые могут взаимодействовать с солью тетразола.

При определении дегидроаскорбиновой кислоты ее переводят в аскорбиновую 3О кислоту и определяют описанным способом, восстанавливают при помощи органического сульфгидрильного соединения, предпочтительно гомоцистеина, который берется в избытке, в нейтральной или слабощелочной среде, при рН 7-8(при использовании гомоцистеина — при рН 7,5. Если затем для определения образующейся аскорбиновой кислоты устанавливают значение рН, соответствующее слабокислой среде, то взаимодействие реактива. с аскорбиновой кислотой протекает без всяких осложнений, т.е. избыток сульфгидрильного соединения не восстанавливает вновь образующуюся в ходе реакции дегидроаскорбиновую кислоту, и, таким образом, не происходит искажения результатов анализа.

Способ позволяет определять дегидроаскорбиновую кислоту в присутствии аскорбиновой кислоты. Для этого вначале определяют в пробе содержание аскорби5t новой кислоты, а затем во второй пробе восстанавливают дегидроаскорбиновую кислоту и определяют ее. По разности полученных результатов можно определить количество в пробе дегидроаскорбиновой

SS кислоты.

Реакция согласно предлагаемому способу протекает примерно 30 м :н, 20 6

Измеряют интенсивность окраски образующегося окрашенного соединения, например, обычным фотокопориметром при подходящей длине волны, например при

578 нм. Однако для определения интенсивности окраски можно использовать и другие известные методы. Удовлетворительные результаты дает и оценка по сравнению полученной окраски с эталонной, в особенности, когда предлагаемый способ проводится с использованиеМ индикаторных полос.

A. Определение аскорбиновой кислоты.

Готовят раствор следующего состава; г/л (%):

Hci2Ípo4 36 (3,6)

Лимонная кислота 20 (2 )

Тритон Х-I I 15 (1,5)

ЕДТА 0,45 (0,045)

МТТ 0,041(0,0041)

В две кюветы (одна из них содержит пробу, вторая — холостую пробу)„заливают по 3,00 мл раствора и 0,1 мл исследуемой пробы. Пробу и холостую пробу нагревают до 37ОС. К холостой пробе добавляют 0,00033% аскорбатоксидазы (0,01 мг/Змл) и инкубируют 2 мин. При этом аскорбиновая кислота разлагается.

Затем к обеим пробам добавляют по

0,075 мг ФМС так, чтобы содержание раствора в них составляло 0,0025%.

Снова инкубируют 5 мин. После этого определяют экстинкцию холостой пробы (Е ) и пробы (Е ). Рассчитывакт дЕ по формуле

dE = ЕрЕ .

Содержание аскорбиновой кислоты в пробе рассчитывают исходя из общей расчетной формулы для определения концентраций с ЧМа

E8 V 4000 где Ч - испытуемый объем, мл

v — объем пробы, мл;

М Q — молекулярный вес определяемого вещества;

Й -толщина слоя, см;

Š— коэффициент экстинкции МТТ-формазона (при 578 нм б 16,9), л ° ммоль "см,.".

Отсюда для L, -аскорбиновой кислоты

1, 70 (76, 1Ъ

C- .ВЕ

46(9- 1. 0(10 . 100 (г g -аскорбиновой кислоты на л раствора пробы) .

Приготовление растворов:,1S а) буферный раствор (фосфатный буфер, 0,1 ммоль/л, рН 7,5) 163 мг КН РО и 2 00 r К РО, 3 Н О растворяют примерно в 70 Мл воды и доливают до 100мл б) раствор гомоцистеина. 60 мг гомо-2О цистеина растворяют в буферном растворе (а) и доливают до 50 мл.. в) раствор щюбы с аскорбиновой кислотой + ДГА (не больше 0,6 г/л).

Значение рН пробы доводят до 7,5 р5 раствором едкого калия (2моль/л) ., и разбавляют водой до пригодной концентрации.

В пробирку вносят пипеткой по 50 мл растворов (а), (б) и (в), смешивают их и оставляют на 15 мин при комнатной; температуре. О, 1 мл инкубированного раствора исследуют на содержание аскор, биновой кислоты согласно А.

Расчет.

1. Общее количество аскорбиновой кислоты (ДГА + аскорбиновая кислота) Ч -Ч ° МС F

С йЕ, пРо, в-Y„-Y,1 ° д "(ррр где FY

1 ч

Ч

1 фактор разбавления пробы; инкубационный объем, мл; испытуемый объем, мл; объем раствора пробы (в) тгри инкубировании, мл; объем инкубированного раствора в тесте, мл; молекулярный вес аскорбиновой

SO кислоты толщина слоя, см, коэффициент экстинкции МТТформазона (при 578 нм

=16,9), л ммсип,"-см", S$ т.е, 1,б.2.,7 176 iИ F р g.gyes.p

<6,9 0,5 0,1 4 100

7 9711

Если предварительно пробу разбавляют, то результат умножают на фактор разбавления F .

Б. Определение дегидроаскорбиновой кислоты (ДГА). 5

Восстанавливают ДГА до аскорбиновой кислоты в присутствии гомоцистеина (при рН 7,5). Определяют сумму аскорбиновой кислоты и ДГА и рассчитывают в виде общего содержания аскорбиновой кислоты. 1О

После Ъычета определенной в отдельном тесте аскорбиновой кислоты из разницы можно рассчитать количество ДГА.

20 8

2. Аскорбиновая кислота из расчета пробы (г/л щюбы).

3. Дегидроаскорбиновая кислота.

C+ra = (результат из(1)- результат из (2)) 0,9886 (г ДГА/л пробы)

NG, 174, 13

176, 13

+ acкорб

Исследуют сок черной смородины на

:одержание в нем аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислоты.

0,1 мл сока исследуют согласно А на содержание аскорбиновой кислоты, при этом а Е равно 0,43 что соответствует содержанию 0,121 г/л или 0,0121%.

Для ойределения содержания в нем дегидроаскорбиновой кислоты 0,5 мл сока обрабатывают согласно Б гомоцистеином.

0,1 мл полученного при этом инкубированного раствора исследуют согласно А на сумму аскорбата и дегидроаскорбата.

Е при этом равно 0,38. Отсюда по указанной в Б формуле рассчитывают сумму аскорбата и дегидроаскорбата, равную

0,329 г/л или 0,0329%. Содержание дегидроаскорбата составляет 0,329-0, 121=

=0,208 г/л или 0,0208%.

Проведена серия опытов определения аскорбиновой или дегидроаскорбиновой кислоты.

Пример 1. Фосфатно-цитратный буфер, поверхностно-активное вещество, комплексообразователь, corn тетразола, ФМС, а также воду и исследуемую пробу вводят в кювету обычного фотокалориметра.

После осуществления, реакции измеряют разность экстинкции по сравнению с воздухом или водой. В параллельную холостую пробу вводят, кроме того, аскорбатоксидазу (ААО). Такое же количество ААО вводят в исследуемую пробу после окончания реакции, чтобы скомпенсировать разницу в экстинкции, обусловленную самой

ААО.

Подробности проведения способа, применяемые реактивы и их количества приведены в табл. 1.

Реактивом приведенного выше состава можно определять от 5 до 250 мг аскорбата в исследуемой жидкости. При более высоких концентрациях пробу необходимо соответствующим образом разбавить, при меньших концентрациях брать большее копичество пробы. Копичество воды при этом соответствующим образом должно быть уменьшено.

9711

При проведении всех последующих определений используют составы реагентов аналогично примеру 1 (табл. 2).

Пример 2. Определение аскорбата в апельсиновом соке. $

0,1 мл апельсинового сока вводят в кювету в качестве пробы аналогично примеру 1. В результате обнаруживают концентрацию витамина С 305 мг/л, что соответствует декларации (300 мг/л). 10

После анализа количество аскорбиновой кислоты, введенной в пробу, полностью определяется (100%). Окраска с течением времени не изменяется. Небольшое помут,нение апельсинового сока не оказывает 1$ влияния на результаты анализа.

Пример 3. 2,0 лимонного напитка растворяют в 20 мл воды и 0,1 мл полученного раствора вводят в кквету по примеру 1. Находят 96 мг витамина 2я

С на 100 r сухого вещества. Изменения окраски с течением времени не наблюдается. Определяют 99,2% аскорбиновой кислоты, добавленной в пробу перед разбавлением. Небольшое помутнение раст- 2$ вора не оказывает влияния на результаты анализа.

Пример 4. Определение аскорбата в плодах шиповника.

5 мл концентрата шиповника раство- 30 ряют в 100 мл воды. 0,1 мл полученного раствора после центрифугирования вводят в кювету по примеру 1. Находят

1770 мг витамина С в расчете на 1 л концентрата. Н ебольшое изменение окраскиЗ$ во времени, наблюдавшееся в пробе и в холостой пробе, учитывают с помощью экстраполяции. Аскорбиновой кислоты, добавленной к пробе перед разбавлением, обнаруживают 100%. Легкое окрашивание,щ разбавленного экстракта не оказывает влияния на результаты анализа.

Пример 5. Определение аскорбата в соке черной смородины.

1 мл сока черной смородины разбавля- $ ют водой до 10 мл и 0,1 мл полученного раствора вводят в кювету по примеру 1.

Находят 305 мг/л витамина С. Обнаруживают 100% аскорбиновой кислоты, добавленной перед разбавлением. Изменения окраски с течением времени не наблюдается Чтобы проверить, не оказывает ли мешающего влияния неразбавленный сильно окрашенный сок, для снижения в . нем содержания аскорбата его выдерживают в открытой посуде в течение 4 недель в холодильнике. Затем 0,1 мл не:разбавленного сока вводят в кювету. На t ходят еше 93 мг/л витамина С. Интенсив20 10 ная окраска исходной пробы не оказывает мешающего влияния. Изменения окраски с течением времени не наблюдается.

Добавленная в пробу аскорбиновая кислота полностью определяется.

Пример 6. Определение аскорбата в пиве.

Чтобы обеспечичь прозрачность и возможность консервирования в пиво мож- но добавить аскорбиновую кислоту, хотя для баварского пивоварения эта операция не приемлема. Ни в светлом или темном бочковом пиве, ни в пиве в банках при проведении анализа по способу, описанному в примере 1, аскорбиновой кислоты нет. Мешающего влияния не обнаруживают.

Добавленное в пробу количество аскорбиновой кислоты полностью обнаруживают.

Пример 7. Определение аскорбата в шпинате.

Бланшированный свежемороженны и шпинат после оттаивания тщательно пере» мешивают, 50.r его обрабатывают известным способом, но вместо HPO используют метафосфорную кислоту. Вводят 0,2 мл, экстракта, рН которого равен 5. При проведении способа аналогично примеру

1 находят 22 мг аскорбата в расчете на 100 r свежемороженного шпината при содержании в нем 8% сухой массы.

Это соответствует 275 мг аскорбата в расчете на 100 r сухой массы. Из добавленного к шпинату перед экстрагированием количества аскорбиновой кислоты обнаруживают 99,8%. Изменения окраски с течением времени не наблюдают.

Пример 8. Определение аскорбата в картофеле.

50 rкартофеля моют,,измельчают и обрабатывают таким же образом, как и шпинат в примере 7. рН.экстракта устанавливают равным 5 и объем его доводят до 100 мл. После центрифугирования

500 мл вводят в кювету. Обнаруживают

18,9 мг аскорбата в расчете на 1 кг картофеля. Обычно эта величина составляет примерно -150 мгlкг. В данном случае используют старый картофель, сильно высохший и частично проросший. В этих условиях содержание витамина С в нем сильно снижается или даже полностью исчезает. Для проверки к картофелю перед экстрагированием добавляют 75 мг аскорбиновой кислоты, после чего определяют ее в количестве 97%.

Изменения окраски с течением времени не наблюдают.

Пример 9. Определение аскорбата в сыворотке.

) 2

971120

Пример 12. Определение дегидроаскорбиновой кислоты.

Исследуемый материал экстрагируют и в случае необходимости разбавляют так, чтобы содержание дегидроаскорбата составляло 75-1500 мг/л (0,005-0,10%).

Для раствора устанавливают показатель рН, равный 7,5. К двум частям этого раствора добавляют две части К-фосфатного буфера (рН 7,5, 0,1 ммоль/л, 1%, диапазон 0,1-2%). 0,1 мл приготовленного таким образом раствора исследуют через 15 мин аналогично примеру 1 на аскорбат и определяют сумму аскорбата и дегидроаскорбата. Принимая коэффициент разбавления F равным 2 5, можно определить после вычитания полученного ранее содержания аскорбата содержание в пробе дегидроаскорбата.

Спустя 2 ч после введения О, 5 r аскорбиновой кислоты у человека берут на анализ мочу, которую делят на 3 порции: первую (1) используют неизменной, вторую (2) дополняют 0,005% гомоцистеина и третью (3)—

0,01% дегидроаскорбиновой кислоты.

Исследуют их по описанному в А способу на содержание аскорбиновой кислоты (способ Т). Для сравнения используют известные способы: окисление аскорбиновой кислоты и осаждение в виде производного гидразина (способ II) и восстановление дихлорфенолиндофенолом (реактив Тиллманна) в качестве титриметрического метода (способ Ш).

Результаты представлены в табл. 3.

В каждой порции должно быть одинако вое количество аскорбиновой кислоты, и только предлагаемый способ (способ Х) дает одинаковые значения. Способ II частично выявляет добавленную дегидроаскорбиновую кислоту (отклонение в порциях

1 и 2 вызвано неточностью способа).

Способ Ш зачастую дает сильное искажение вследствие введения гомоцистеина, который включается в качестве восстановитетакже вызывает значительное увеличение значения.

Предлагаемый способ определения аскорбиновой кислоты (витамина С) и дегидроаскорбиновой кислоты прост и по сравнещпо с известными способами значительно более специфичен, более устойчив к мешаюшему влиянию других вешеств и менее длнтел ен.

11

Содержание аскорбиновой кислоты в сыворотке должно находиться в пределах между 2 и 15 мг/л на 1 мл сыворотки, из которой с помошью трихлоруксусной кислоты удаляют белок и используют в 5 качестве пробы. B шести раз тичных сыворотках обнаруживают от 1,5 до 2,64мг/л аскорбата. Изменения окраски с течением времени не наблюдают. При добавке в пробу 17,2 мг аскорбата на 1 л сыворот-10 ки вновь обнаруживают практически 100%.

Пример 10. Определение аскорбата в моче.

Содержание аскорбата в моче может достигать значительных количеств. При нормальном питании в мочу попадает от

l0 до 100 мг/л. При приеме доз, больше 100 мг 60-80% принятого количества обнаруживают в моче. Поэтому при потреблении аскорбиновой кислоты в количест20 вах, во много раз превышаюших нормальное, следует ожидать и большее, чем

100 мг/л, содержание ее в моче. В свежей моче при объеме пробы 0,1 мл обнаруживают 257 мг/л аскорбата. При этом вновь обнаруживают 98,3% добавленной перед анализом аскорбиновой кислоты.

Изменения окраски с течением времени .и других мешаюших влияний не наблюдают-.

Пример 11. Большие количества ЗО витамина С в моче, найденные в примере 10, могут частично или полностью подавлять образование окрашенных соединений на обычных индикаторных полосках на глюкозу, кровь KUH билирубин и т.д., основанное на окислении различных лейкоокрашенных соединений, и, таким бобразом, приводить к искажению результатов, что может быть установлено с помсвцью индикаторной бумаги. Круглый фильтр из 40 испытуемой бумаги тщательно промывают раствором 0,2 молИ, Мс НР04 /О, 1 моль/л лимоннокислого буфера с рН 5, отсасывают на вакуумном фильтре и сушат в вакууме при комнатной температуре. Затем на фильтр, лежащий в чашке Петри, наливают смесь, соответствующую по составу холостой пробе примера 1, но не содержащую пробы и аскорбатоксидазы, после чего ля. Однако дегидроаскорбиновая кислота его снова сушат в вакууме при комнатной температуре в темноте. На подготовленный таким образом фильтр наносят по капле растворы, содержашие 2; 5; 10 25 и 50 мг аскорбата/100 мл. В течение 1 мин на бумаге образуются сине-фиолетовые пятI

Ы на, интенсивность окраски которых возрастает с увеличением концентрации аскорбата. При накапываний воды наблюдают только легкое желтое окрашивание.

13,4

971120

Таблица 1

Исходный раствор и ход опыта

Проба, Концентрация при испытании

Холостая проба> мл и с 1НРО, Мд ИРО, 3, 6%

Лимонная кислота 2%

1,5

1,5

Лимонная кислота

4%рН5

Тритон Х 100 1,5%

Тритон Х 100 + 3

ЕДТА 0,09%

ЕДТА 0,045%

1,0

1,0

Вода

0,176-8,8 мг/л аскорбата (0,0000 176-О, 00088%) 0,1

0,1

Проба

ААО" 0,05%

Испытуемый раствор

0,000333%

О, 02

МТТ 0,062%

ФМС 0,0375%

0,2

0,2

0,2

0,2

AAO О, 05

0,02

После введения AAO инкубируют 2 мин.

После введения ФМС инкубируют до прекрашения реакции (около 30 мин).

Таблица 2

Фосфатно-цитратны Й буфер

2,4

0,5

1,5

0,1

1,0

Тритон X 100

ЕДТА

Аскорбатоксидаза

МТТ

О, 00025 0,0005 до 100 до 100

ФМС

Вода

0,01

0,005

0,03

О, 0045

0,0001

О, 0003

О, 00414%

0,025%

0,000333%

О, 045

0,002

0,009

0,0025 до 100

971120

1.5

Таблица 3

0,133(0,0133) 0,130(0,0130) 0,134 (0,0134)

0,14О (OÄ0l40) 0,155 (0,0155) 0,255 (0,0255)

0,144 (0Ä 0144) О, 201 (О, 0201) О, 162 (0,0162) Составитель Л. Русанова

Редактор Л. Пчелинская Техред Е.Харитончик Корректор С. Шекмар

Заказ 8459/81 Тираж 887 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Формула изобретения

Способ определения аскорбиновой или дегидроаскорбиновой кислоты с использо- 20 ванием обработки исследуемой пробы реагентом, содержащим четвертичную соль тетразолия и буферный раствор, с после- дующим измерением интенсивности окраски образующегося окрашенного соединения,>> отличающийся тем, что, с целью сокращения длительности определения и повышения специфичности, берут две пробы, к первой пробе добавляют реагент, содержащий фосфатно-цитратный .буфер, полиэтиленгликолевый эфир октилфенола, этилендиаминтетрауксусную кислоту 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолбромид, феназинметосульфат и воду при следующем соотношении компонентов, вес.%:

Фосфатно-цитратны и буфер 0,5-20

Полиэтиленгликолевы и эфир октилфенола 0,1-1,5 40

Этилендиаминтетрауксусная кислота 0,0045-0, 045

3-(4, 5-диметилтиазол-2) -2,5-дифенилтетразолбромид 0,0003-0,03

Феназинметосульфат 0,00025-0,0025

Вода До 100 и к другой параллельной пробе добавляют указанный реагент, содержащий дополнительно аскорбатоксидазу в количестве 0,0001О, 005 вес.%, вычитают экстинкцию параллельной пробы из экстинкции первой пробы и рассчитывают содержание аскорбиновой кислоты, причем в случае определения дегидроаскорбиновой кислоты первую исследуемую пробу предварительно обрабатывают избытком гомоцистеина при рН

7-8 и содержание дегидроаскорбиновой кислоты определяют по разности между общим содержанием аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот и содержанием аскорбиновой кислоты.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

4, 5cbo r n006er 38rg.,3. HangЬосб der Aebens rni tte6c,ae miе. Sa, М,R ... springer- Чег8с(сС", Ьегк1н— — Helve Obегоn, 4961 . > 4.- 6$

2. Там же, с. 765-769.

3. Там же, с. 765-789 (прототип).