Способ получения тимозина
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Соеетскнз
СОцналнстнчеекнк
Республнн
<и975017 (6)) Дополнительное к авт. саид-ву— (22) Заявлено 170381 (21) 3289181/28-13 с присоединением заявки ¹вЂ” (23) Приоритет—
Опубликовано 231182.Бюллетень ¹ 43
fS<)М.К .
A 61 К 35/56
Государственйый комитет
СССР йо делам изобретений и открытий
t93) УДК 615, 34 (088.8) Дата опубликования описания 23. 11.82
P2) Авторы изобретения
Г.A. Ермолин, В.А. Внуков, A.М. Седов, О.Г. Саканделидзе и Н.С. Дрожжина (71) Заявитель
Центральный ордена Ленина институт усовершенствования врачей (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИМОЗИНА
Изобретение относится к медици. не, в частности к получению сходно гормонального вещества под общим названием "Тимоэин" или гормональный тимусный фактор (ГТФ), обладающего выраженной биологической активностью со специфическими функциями, главным образом в отношении иммунных явлений.
Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаеМОму эффекту является способ получения тимозина, предусматривающий гомогенизацию вилочковой желюзы, центрифугирование, нагревание надосадочной жидкости с последующим охлаждением, обработкой ацетоном, осаждением белков и липидов и пропусканием полученной смеси через хроматографическую колонку.
Согласно известному способу свежий тимус крупного рогатого скота, взятый со льда, гомогенезируют в физрастворе, а затем центрифуги— руют. Надосадочную жидкость собирают и нагревают до 80оС и после удаления осадка фильтруют через мелкоячейные фильтры (0,45 р ), после обработки ацетоном, фильтрования и повторного осаждения при помощи (NHg) S04 при pH = 4,0, пропускают через хроматографическую колонку и получают чистый тимозин (5-я фракция) (1).
К недостаткам известного способа относится то, что он не позволяет получить максимальное количество целевого продукта, обладающего достаточной биологической активностью.
Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта и повышение его активности.
Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения тимозина, предусматривающему гомогенизацию вилочковой железы, центрифугирование, нагревание надосадочной жидкости с последующим охлаждением, обработкой ацетоном, осаждением белков и липидов и пропусканием полученной смеси через хроматографическую колонку, вилочковую железу каспийского тюленя 10-15 дневного возраста перед гомогениэацией очищают от соединительной ткани, гомогенат пропускают через ультраторакс и проводят полную дезинтеграцию оставшихся клеток ультразвуком, осаждение белков и липидов осуществляют добавлением 10 мМ раствора фос975017 форнокислого натрия при рН 7,07,2 и соотношении ° 1:9-1:10, далее центрифугируют, полученный супернатаит подкксляют 10%-.ным раствором уксусной кислоты до рН 4,0-4,2, затем обрабатывают 50%-ным раствором сернокислого аммония, центрифугируют, к образовавшемуся осадку добавляют 10 мМ трио-хлор буфер при рН = 8,0-8,2, лиофилизируют и до пройускания через хроматографи- 10 ческую колонку к полученному сухому осадку добавляют 10 мм трис-хлор буфер.
Способ осуществляют следующим об,разом. 15
Вилочковую железу (тимус ) в замороженном состоянии (-49 С ) добавляют в лабораторию и размораживают при комнатной температуре. Затем следует максимальная очистка тимуса от соединительной ткани, гомогениэация с физраствором в соотношении 1:3, ультраторакс, дезинтеграция ,оставшихся клеток ультразвуков. После центрифугирования при 12000 9 удаляют осадок, а супернатант (1-я фракция)нагревают до 80 С с последующим центрифугированием (45000 g), Полученный супернатант является
2-й фракцией, которую затем при 4 С обрабатывают ацетоном (предварительно)охлажденным до -10 С в соотношении 1:5. Полученную смесь центрифу гируют (15000 g), после чего полученный осадок (3-я фракция) растворяют 10 мМ раствором NaPO4 (рН = З5
7,0) в соотношении 1:10, добавляют (ЙН, ), 504 насыщенного раствора в количестве 25Ъ к предыдущему объему. После кратковременного центрифугирования полученный супернатант 40 подкисляют 103-ным раствором СН СООН до рН 4,0 и добавляют 50%-ный раствор (NH4) S04. Далее центрифугируют 15 мин, полученный осадок растворяют 10 мМ трис-Сl буфером 45 (pH = 8,0) и лиофилизируют (4-я фрак— ция). После этого сухое вещество растворяют в минимальном количестве 10 мМ трис-Сl буфере и пропускают через хроматографическую колонку
Sephadex с коллектором фракций для получения 5-й фракции ГФТ. Полученный материал лиофилизируют.
Пример. Каспийский тюлень
Phoca caspiса был добыт в марте
1980 г. на ледовых залежах Северного Каспия. Из препарированных тушек были извлечены тимусы в количестве
1,0 кг и заморожены (-10 С). Через две недели размороженные при комнатной температуре железы были очищены от соединительной и зпителиальной тканей, пропущены через мясорубку и затем помещены на время (10-15 мин) в гомогенизатор. В образовавшийся гомогелат добавляют 65 физраствор. (0,15 М раствор NаС 1) в соотношении 1:3 и продолжают обработку на ультратораксе в течение
10-12 мин, После этого весь материал центрифугируют 1 ч (12000 g) и после удаления осадка получают 1-ю фракцию.
Надосадочную жидкость сливают в колбу с термостабильным стеклом и помещают в водяную баню, температуру в которой постепенно доводят до
80 С, затем вынимают колбу и охлаждают. Потом следует центрифугирование (45000 g) в течение одного часа, полученный супернатант является 2-й фракцией. Затем его помещают в холодильник (-4 С) на 1,5 ч после чего смешивают с охлажденным при
-40 С ацетоном (ХЧ) в соотношении
1:5. Смесь центрифугируют (15000 g) при низкой температуре в течение одного часа. Полученный осадок является 3-й фракцией ГФТ.
Осадок затем растворяют в 10 мМ растворе NaPO4 (рН 7,0) в соотношении 1г10, добавляют (NH4)gSOp (насыщенного раствора) в количестве
25% к основному объему. После 15-ти минутного центрифугирования (3500 об/мин) полученный супернатант подкисляют 10%-ным раствором
СН9СООН до рН = 4,0 и добавляют
50%-ный раствор (NH<) Фракцию с молекулярным весом 12200 подвергают лиофилизации (5-я фракция). Вещество представляет собой белые кристаллы, хорошо растворимые в воде. Конечный выход-вещества из 1 кг сырого веса примерно 250 мг лиофилизированной 5-й фракции ГФТ, а выход аналогичного тимозина, полученного из тимуса крупного рогатого скота по известному способу соответственно, 120 мг. Для сравнения биологической активности стандартного тимозина и ГФТ из морских млекопитающях были поставлены серии опытов на линейных мышах7,, СВА С57В1/б), зараженных 5àl monella typhimurium.Âñåãî было заражего 90 мышей. Результаты опытов показывают, что действие ГФТ из морс ких млекопитающих по своей активности 1,100%-я защиты от инфекции выше аналогичного тимоэина из крупного рогатого скота почти в 2 раза. 975017 Выживаемость Группа Доза препарата, мкг/мышь Опыт 10 (Контроль (без тимозина) Тимоэин иэ телят 15,0 . 60 15,0 100 иэ тюленя Составитель С. Каспаров Редактор A. Шишкина Техред N.Tenep Корректор Г. Решетник Заказ 8864/4 Тираж 714 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий . 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 Биологическая активность стандарт ного тимоэина и тимоэина иэ тимуса крупного рогатого скота представлена в таблице. Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным, Позволяет увеличить выход целевого продукта в 2 раза. Тимоэин, получаемый предлагаемым способом, обладает более биологической активностью (действие тимозина, полученного предложенным способом, было выше почти в 2 раза, чем тимозина, полученного известным способом ) ФОрмула изобретения Способ получения тимоэина путем гомогеиизации вилочковой железы, центрифугирования, нагревания надосадочной жидкости с последующим охлаждением, обработкой ацетоном осаждением белков и липидов и пропусканием полученной смеси через хроматографическую колонку, о тл и ч а ю щ и и .с я тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и повышения его активности, вилочковую железу каспийского тюленя 10-15 дневного возраста перед гомогенизацией очищают от соединительной ткани, гомогенат пропускают через ультраторакс и проводят полную,дезинтеграцию оставшихся клеток ультразвуком, осаждение белков и липидов осуществля т добавлением 10 мМ раствора фосфорнокис-лого натрия при рН = 7,0-7,2 и соотношении 1:9-1:10, далее центрифугируют, полученный супернатант подкисляют 10%-ным раствором уксусной кислоты до рН = 4,0-4,2, затем обрабатывают 50%-ным раствором сернокислого аммония, центрифугируют, к образовавшемуся осадку добавляют 10 мМ трис-хлор буфер при рН = 8,08,2, лиофилиэируют и до пропускания через хроматографическую колонку к полученному сухому осадку добавляют 10 мМ трио-хлор буфер. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1 ° Gotdsteln А. Proc. Mat!. Acad. Se!. USA, 1972, 69, р. 1800.
