Способ разделения аминокислот

 

Союз Советсиик

Социалистичесиих

Ресттубпни

{»> 979991

Ф

) г (6I ) Дополнительное к авт. Синд-ву (22) Заявлено 04.01.81 (21) 3258478/23-04 с присоединением заявки Р& (28) Приоритет

6 01 1{1 31/08

3Ъсударстааннь и каннтет

СССР по делам вэабретеннй н открытий

ОпУбликовано 07.12.82. Fioäлете»ь ь;. 45

Лата опубликования описания 07.1" 82 (72) Авторы изобретения

И. 3, Еирпсбауме, В. Ж, Оэолиньш Л. А. Ла::зс,)М. - { .{с",Т11м:.

A. О, Рудзите и И. Л Бс}тз1а1{1 т !

/ (71) заявитель (54) СПОСОБ РАЗДЕЛЕ}1ИЛ АМ1}ИОК}}С.{Ю1

Изобретение относится к аналитической химни, а именно к способам разделения смесей аминокислот методом жидкостной хроматографии.

Известен способ разделения смесей аминокислот жидкостной хроматографией с использованием полистирольного катионита и злюентов на основе Нитратов натрия, калия л лития при 45--65 С (1}.

Недостатком зтого способа является сложность проведения разделения из-за необ." Однмости подцерживания повьппе1псой температуры (45 — 65 С).

Наиболее близким по технической сугцности и достигаемому результату к изобретению является способ разделения аминокислот путем растворения анализируемого вегцества в цитратном буферном pBOTBopG, нропускания через колонку, заполненную катионообменным сорбентом, полистирольным катионитом со средним размером зерен 17 мкм с последу1егцим элюированием сорбироваяного вегцества растворителем на основе цитрата литиЯ с добавками монометилового Эфира

Зтт>ЛЕНГЛИКО-;,"„. », »{{1,:,,- {,{.11;1 ОИ i., -.:. »11Ь!

i! КаПРИЛОВОй КИС1{ОТ11 11{О{1 . .:: .11С{агУ1-,- КОлонки 36-40 С (.":{, Недостатком изве{:т{101 О с!1 -.{, с{б: 11г{л:с -.тся

CJi0 TTOCTb 1TpOB=",!C!T»{1 !{}.OTi{ ;.C.,1 }1аз.TC!1{ч1;{я из- за необходимости iTo;. l{!;i:.-.:»è»iã {111Н1п1{1с11ной температуры (36--40 С).

Цель изобретения — упро1цепие способа разделения аминокислот.

ПОстсlвлснлая 1\ель лосси{ асс{ ся те".1. >To согласно с1 Особу fõ!1ДС11»liF С1!{!» {!;!{c:lот п1 тем растворения анализируемого вегнсства г цитратном буферном растворе, 11} О11} ска11пя через колонку при тсмпспатуре 18-- {1 С, заТ5 полнен11утО Гликольметакрсгла1ныь! 1;ат{1{л1111!TM с 11азмером зсрен 10 63 !!:!м. {. {1О{ 11с 1{.101 Т1{м злюировапием сорбирова{111огс вс111 тва раство

РИтЕЛЕМ На ОСНОВЕ НИТРата ПаГРИЯ Л са:-1ССТВС катионообменного сорбент» ис>{олъзуит глиl0 кольметакрилатный кати{111»т с }11з.се}1ОМ зерен 10 — 63 мк м и п ропе сс "-:! 3) сс."1{пи Я в слу т при температуре колопки i8--." 0 С.

Положительньсй эффскт:1осгиг{е{ ся 11рименснием сферона-8. 11 сею{{1.. О гл,;!{T.*.ü ":. ;;:.

97999

Таблица 1

Анализируемые аминокислоты Взято, мг Найдено, м

Относительная ошибка, %

0,0131

0,0133

0,0117

0,0149

0,0131

-1,5

Гидроксипролин

-0,7

Аспарагиновая кислота

+0,8

83JTHH

+0,7

Метионин

-0,8

Лей цин

+0,0

0,0165

+1,7

0,0181

0,0155

0,0174

Тирозин

+0,6

Гисеидин

-1,7

Аргинин

3 крилатную матрицу. Матрица обладает повышенной гидрофильностью из-за наличия в ней гидроксильных групп, связанных с алифатическим углеродным скелетом. Наличие гидроксильных групп в матрице препятствует неионпым взаимодействям между матрицей и разделяемыми аминокислотами, расширешпо их полос в элюенте и смешиванию при 18 — 20 С.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. 1О

Разделяемую смесь 1х10 — 1я10 М аминокислот растворяют в буферном растворе

0,2 н. цитрата натрия (рН 2,2). Раствор элюируют с колонки размером! 27 — 50 х 0,8 см, наполненной гликольметакрилатным катионитом сфероном-S с диаметром частиц 10tв

63 мкм, водными буферными растворами шгграта натрия. До 25-ой мин от начала хроматографирования концентрацию иона натрия в элюенте поддерживают в пределах 0,1—

0,2 и., а рН 3,0 — 3,25. От 25-ой и до 60-ой мин от начала хроматотрафирования концентрация иона натрия в элюенте в пределах

01 — 0,2 н., а рН 4,2 — 4.3, от 60 до 130-ой мин от начала хроматографирования концентрация иона натрия в элюенте в пределах 1,0 — 1,2 и.. а рН 6,4 — 6,5. Все элюенты содержат также

0,01% каприловой кислоты, а элюент с рН

3,0 — 3,25 также 0,5% тиодигликоля и 4,0%, этилового спирта. Скорость элюирования

60 мл/ч при давлении 2 — 20 атм, ТемлератуПример 2. Аминокислоты: пролин, глутаминовую KHGJIQTY, лейнин, фенилаланин. гистидин, аргинин {10 М каждой) раствора в колонке в зависимости от температуры окружающей среды (18 — 20 ), Колонка не нагревается и не термостатируется.

Пример 1, Аминокислоты: гидроксипролин, аспарагиновую кислоту, валин, метионин, лейцин, фенилаланин, тирозин, гистидин, аргинин (10 М каждой) растворяют в буферном растворе 0,2 í. цитрата натрия, (рН 2,2). Раствор элюируют с колонки размером 27 х 0,8 см, наполненной гликольметакрилатным катионитом сфероном-S с диаметром частиц 10 — 25 мкм, водными буферным растворами щгграта натрия. До 25-ой мин от начала хроматографирования концентрация иона натрия в элюенте 0,1 н., рН 3,0.

От 25-ой мин концентрация иона натрия в элюенте 0,1 н., рН 4,2. От 60-й до 100-й мин от начала хроматографирования концентрация иона натрия в элюенте 1,0 н., pH

6,4. Все элюенты содержат также 0,01% каприловой кислоты, а элюент с рН 3 также и

0,5% тиодигликоля и 4,0% этилового спирта.

Скорость элюирования 60 мл/ч при давлении 15 — 20 атм. Времена выхода аминокислот, мин: гидроксипропилина 19, аспарагиновой кислоты 22, валина 30, метионина 35, лейцина 43, фенилаланнна 65, тирозина 76, гистидина 80, аргинина 92. Температура в колонке 18 С. Колонку не нагревают и не термостатируют.

Результаты анализа представлены в табл. 1.

0,0129

0,0132

0,0118

0,0150

0,0130

0,0165

0,0184

0,0156

0,0171 ряют в буферном растворе 0,2 н. нитрата натрия (рН 2,2). Раствор элюируют с колонки размером 27 х 0,8 см, наполненной гли979991 6 жат также 001% каприловой кислоты, а элюент с рН 3,25 также и 0,5% тиодигликоля и 4,0% этилового спирта. Скорость элюирования 60 мл/ч при давлении 3 — 6 атм.

5 Времена выхода аминокислот, мин: пролина

28, глутаминовой кислоты 39, лейцина 48, фенилаланина 62, гистнцина 77, аргинина

92. Температура в колонке 18 C. Колонку не нагревают и не термостатируют.

14 Результаты анализа представлены в табл. 2.

Таблица 2

Анализируемые аминокислоты Взято, мг Найдено, мг Относительная ошибка, %

Пролин

Глутаминовая кислота

+0,9

+2,0

Лейцин

1,65

Фенилаланин

Гистидин

+0,6

0,0174

+0,0

Аргинин рН 4,3. От 60-ой до 130-ой мин концентрация иона натрия в элюенте 1,2 н., рН 6,5.

Все элюенты содержат также 0,01% каприловой кислоты, а элюент с рН 3,25 также и 0,5% тиодигликоля и 4,0 этилового спирИ та. Скорость элюирования 60 мл/ч прн давлении 2 — 4 атм. Времена выхода аминокислот, мин: аспарагйновой кислоты 31, глнцнна 36, изолейцнна 44, тирозина 50, лизина

73, аргинина 97. Температура в колонке

4О 20 С. Колонку не нагревают и не термостатируют.

Результаты анализа представлены в табл,З.

Таблица 3

Взято, мг Найдено, мг Относительная ошибка, %

Анализируемые аминокислоты

+1,5

Аспарагиновая кислота

Глицин

-1,5

Изолейцин

+0,6

Ти розин

Лизин

-1,4

-1,7

Аргинин

5 кольметакрилатным KRTMQHHTGM сфероном-S ,с диаметром частиц 25 — 40 мкм, водными буферными растворами цитрата натрия. До

25-ой мин от начала хроматографирования концентрация иона натрия в элюенте 0,1 н„ рН 3,25. От 25-ой до 60-ой мин концентрация иона натрия в элюенте 0,1 н, рН 4,3.

От 60-ой до 130-ой мин от начала хроматографирования концентрация иона натрия в элюенте 1,0 н., рН 6,5. Все элюенты содерПример 3. Аминокислоты: аспарагиновую кислоту, глицин, изолейцин, тирозин, лизин, аргннин (10 М каждой) растворяют в буферном растворе 0,2 н цитрата натрия (рН 2,2), Раствор элюируют с колонки размером 50 х 0,8 см, наполненной гликольметакрилатным катионитом сфероном-S с диаметром частиц 40 — 63 мкм, водными буферным растворами цитрата натрия.

До 26-ой мин от начала хроматографирования концентрация иона натрия в элюенте

0,2 н., pH 3,25. От 25-ой до 60-ой мин конпентрация иона натрия в элюенте 0,2 н., 0,0115

0,0147

0,0131

0,0165

0,0155

0,00133

0,00075

0,00131

0,00181

0,00146

0,00174

0,0116

0,0150

0,0129

0,0167

0,0156

0,0174

0,00131

0,00075

0,00129

0,00182

0,00144

0,00171

Составитель 8. Гладков

Техред A.À÷ Корректор Л. Бокшан

Редактор В, Лазаренко

Заказ 9349/33

Тираж 887 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

7 97999

Технико-экономический эффект предлагаемого способа заключается в упрощении процесса, т.е. в отсутствии необходимости подогрева, термостатирования .и другой регулировки температуры колонки. Упрощается хроматографическая аппаратура и ее обслуживание, а также экономится электроэнергия.

Формула изобретения fO.Способ разделения аминокислот путем растворения анализируемого вещества в цитратном буферном растворе, пропускания через колонку, заполненную катионообменным сорбентом, й

1 8 с последующим элюированием сорбированного вещества растворителем на основе цитрата натрия, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве катионообменного сорбента используют гликольметакрилатный катионит с размером зерен 10 — б3 мкм и процесс разделения ведут при температуре колонки 18 — 20 С, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Козаренко Т. Д. Ионообменная хроматография аминокислот. М., "Химия", 1975, с. 17 — 32.

2. Авторское свидетельство ЧССР У 150094, кл. G 01 N 31/08, 29,09.72 (прототип).