Способ консервирования спермы животных
ОПИСАНИЕ .ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Советских
Социалистических
Республик
<и986411 (6!) Дополнительное к авт. свид-ву — . (22) Заявлено 04. 12 ° 79 (23) 2846902/30-15 с присоединением заявки № (23) Приоритет—
Опубликовано 07.01.83. Бюллетень ¹ 1
Р М К з
A 61 D 7/02
Государственный комитет
СССР. но делам изобретений и открытий (53) УДК 66,099 ° 4:
:591 ° 463.1 (088.8) Дата опубликования описания 07.01.83 (54) СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ СПЕРЭйй ЖИВОТНЫХ
Изобретение относится к области искусственного осеменения сельскохозяйственных животных, в частности к способам консервирования спермы дутем замораживания.
Известен способ консервирования спермы животных в пайетах, включающий разбавление спермы до половины конечной стадии разбавления защитной средой, содержащей ЗЪ глицерина, охлаждение разбавленного семени до
+4оС за 45-60 мин, вторичное разбавление семени защитной средой, содержащей 113 глицерина, расфасовку, -в соломинки, эквилибрацию и, наконец, замораживание его с последую- . щим оттаиванием (1).
Недостатком этого способа является быстрое охлаждение семени до
+4 C отрицательное влияние высокой концентрации глицерина и длительного времени контакта с ним живчиков, которое проявляется в нарушении апикального края акросомы, разрушении устойчивости белково-липоидных комплексов, а после замораживания и . оттаивания семени быков-производителей снижается подвижность живчиков и абсолютный показатель их живучести.
Кроме того, при длительном контакте живчиков с глицерином имеет место утечка ряда ферментов, аминокислот, жирных кислот и функциональных групп из клеток сперматозоидов в плазму что ведет к снижению биолоl гической полноценности спермы.
Известен также способ консервирования сперьы животных, включающий ее разбавление на первом этапе безглицериновой защитной средой, а на втором этапе — защитной. средой с глицерином. При этом охлаждение прово дят в течение 2 ч от 30 до 40 С; а замораживание проводят при -80оC (2).
Однако длительный контакт (более
30 мин) живчиков с глицерином приводит к нарушению устойчивости белково-липидных комплексов, морфологическим изменением акросоьы, выходу в плазму из живчиков ферментов.
В результате этого значительно снижается активность живчиков после оттаивания и составляет примерно 22,5 балла.
Целью изобретения является повышение жизнеспособности и биологической полноценносаи сперматозоидов после замораживания и оттаивания.
986411
Таблица1
Режимы охлаждения семени
Температурный и временной режимы Режимы охлаждения
) 2 от +30 до +15 С от +15 до +10 С
0,2
0,5
0,4
0,3
0,4
0,3
0,2 0,2 от +10 до +4 С
Время охлаждения семени до +4 C мин
0,3
0,2
0,1
0,1
85
160 135
Цель достигается тем, что охлаждение спермы проводят от +30 до.
+15" С со скоростью 0,4-0,5 С/мин от +15 до +10 С со скоростью 0,30,4 С/мин и от. +10ьдо +4 C со скоростью О, 2-0, 3 С/мин, эквилибрацию с глицерином проводят при +4-+5 С течение 25-30 мин, а замораживание спермы проводят в парах жидкого азота при температуре -120--140 С в течение 8-8 5 мин.
Пример. Технология приготовления и консервирования семени сель.скохоз яйственных животных заключается в следующем. Вначале готовят защитную среду для разбавления семени.
Для приготовления используют лактозу, фруктозу, рафинозу, сульфат магния, куриный желток и спермосан-3.
Разбавление семени вышеуказанной средой проводят на половину конеч- 2() ной степени разбавления: температура. среды в момент разбавления +30 С.
Баночки с разбавленной спермой помещают в ванночки с водой, темпе-.; ратура которой +30 С, и переносят в холодильную витрину с постоянной температурой +4 С.
Охлаждение семени проводят трехступенчато: от +30 до +15 С, от +15 до +10 С и от +10 до +4 С. Охлаждение проводят путем добавления кусочков тающего льда или воды комнатной температуры °
При проведении опыта взято несколь ко режимов охлаждения и изучено их влияние на биохимические и физиоло()3 гические показ ат ели живчиков после замораживания и оттаивания семени (см табл, 1) °
Установлено, что оптимальным режимом охлаждения является режим 3. 4()
После охлаждения и выдержки семени при +4 С в течение 3,0-3,5 ч сперму разбавляют вторично той же защитной средой, но содержащей дополнительно 10 мл глицерина на 100 мл. 45 дистиллированной воды.
Температура среды в момент допол» нительного разбавления равна +4 С.
После второго разбавления семени лактозо-фруктово-магниево-желточной средой, содержащей дополнительно глицерин, проводят расфасовку семени вручную или автоматически в полимерные соломинки объемом 0,5 мл, выдерживают их в витрине холодильника в течение 30 мин, после чего семя сразу замораживают.
Замораживание проводят в широкогорлом сосуде Дьюара, для чего соломинки раскладывают горизонтально на специальной рампе и помещают ее над парами жидкого азота на уровне
3-4 см от уровня азота при следующих температурах (см. табл. 2).
Время замораживания составляет .
8 мин.
Температуру замораживания семени контролируют термопарой и регулируют расстоянием от уровня жидкого азота до рампы, где горизонтально были расположены соломинки с семенем. (Q
Время выдержки семени в парах жидкого азота составляет 8 мин, после чего соломинки опускают в жидкий азот, где их карантируют в течение
30 дней, а затем переводят в спермобанк для дальнейшей отправки в хозяйства.
В результате контакта семени с глицерином в течение 30 мин улучшаются биохимические и физиологические показатели живчиков, в частности такие, как подвижность живчиков и продолжительность их жизни после оттаивания (см. табл. 3).
При предложенном режиме охлаждения достигается стабилизация морфологическнх, биохимических и физиологических показателей семени (см. табл. 4).
Данные показатели характеризуют. семя до его замораживания.
В табл. 5 приведены качественные показатели семени быков-производителей после оттаивания.
Предложенный способ позволяет улучшить качество оттаянной спермы, повысить оплодотворяемость животных при снижении количества доз семени.
9864Ы
Та блица 2
Влияние различных режимов замораживания семени быков-производителей на подвижность и продолжительность жизни живчиков после оттаивания
Температура замораживаоС
Показатель
Ойыт, В
1 -120 4,6+0,21 8,.8+0,2Ф
8,8+0,2»
9,0+0,3
4,6+0,18
4,6+0,21
4 2+0,35 7,6+0,5
" -различия статистически достоверны по отношению к прототипу.
2 -130
3 -140
4 -160 подвижность . продолжительность
ЖИВЧИКОВ ПО ЖИЗНИ ЖИВЧИКОВ ПО сле оттаива- сле оттаивания при ния, баллы 37 С, дии абсолютный пока-. затель живучести живчиков при
+2-+4 С (S„) 592,8+25,9"
593+24,5"
590 26с9
446,4 17 1
986411
l 1 I
1 I
l 1
Ю Ф с
СО М
4l +I
«Ф (О 1" л л!
>г (Ч 4 с с (О .+! . 4» сО л г- гл
U1 (О
+I (Ч
ЧО
СО с
Г СО
Ф! +!
CO CO
«Ф (г> л
1
I
t(4 х ц о о х а (4
Ю
4-1
Ю с о
\ х е(Р ((4 О х 2
K x
v x х x x ххх
Lt> (d 5 ((> Ц
K М (а ,(4 и и хо о х х (а Р1 ,(> х о (х Е
5 ((1 Х
И
Х 1-» 5 к о а (O 6 t ц(" .о о и
o. o
Р х
1 1 1! 1 1
1
СО л о
+!
ГЧ
t ((1 LA (4 (Ч
o o
+! + о ст с (с (О м (ч с о о
4.(+4
°:Р с г- гм с о о
+I +I
«Ф 3 с с
Г Г" м
«
Ю
+!
С>
Г (Ч о
Н (Ч с г1
1
1 тР
I о
М х (ч о
1ч о а
Мс
ГЧ (> с с о о
+! +!
CO tA с
t r(4 Г4 с с о ю
+! +!
tA СО с г г1
1
1 м
1 (4 о
+! (Г» (Ч
«
С>
+! м
Г г> с с
o o
4! + м м> с
Г Г м
Ю
4» с3
Я х х
8 о х
14 о
I
1
l (4
1
Ul
Г4 о о
+1 +I
tA « P с г- t (Ч с
Ю
+! (Ч с
Г 4
С>
+I
«:У г (4
Ю
+! л ( (ч м с о о
+! +I (O (1 с
f м (Ч с о ю
+! +1 ю о с гК
1 Х
I Х
1 ((1 Х ((4 X
I X В
1., E-t >(1 о (".
1 >С в о
1 1 и д о о, х ((> K о в а
1 ((> о
I Х я х
1-!
1 (> И
11 О
v Е
Х 0
1 ° K х х
I Я (б (> 1
Ц 1 о 1
I а 1
1 1» 1 х о A — — - — — l л! с
С>
Il (-!
LA
Г4
« о х (4 х а в о
1-» и о
Ц х. х и х
14 ((1
1.! и
I - !
СО
Ю с о
4.> (Л
-» с
«
ГЧ г4 л! с
o o
+1 +!
Ul LA
М ГЧ4
«Ф «4 Ф
СО Л
О с о о -+!
+I й> м м
«Ф тг
CO (Ч
Ю о
o l!
Ф! Ul о с с ,> «;(\ г о
Ю Ю
+! +
Ul ((1 (Ч (4 с с 4««:Р
О1
Ю
С>
+!
Г 4 Ф
» о
+! (4
«:г (Ч о
+! й> (Ч
-! ГЧ с
Ю
+! o
tA
Г"> LA с «4 Ф
>>(« 3 с о,о
+! +1 ч) м с с
«Ф сФ! с
Ю
4-!
tA г4 с :1 ! с
С>
+ м г (Ч ((1 ь Л о
+! С>
tA +I (Ч М с Ф «(г (4 ь о
o +!
+1 й> (Ч ГЧ
«:Р 3 (г>
»
Ю
+! ! с (г
Г 1 л! с о о
+1 +!
«4 (Ч с Ф г
LA л»
Ю
+1 г4 с
d1 м
С>
+I м
\ Ф х "х
xo@ (".
К40 о-о м
tII Ц
xex xKx
ЯО В 6 Х
6 (t> 3 Cf fh
a(d6O6!
I
4 ааииа
Х 6 х х а> х
z v
6 6
v y х
gß х
t91 в х (tl 6
О Х (d V о,в
О»
o x г» о ,а о ц х
6 33 I>4 о
Х (d х х
Ц о -р х х охи
И. а
В 11
L; х а> (., o t ж ((> ((1
Х 6 Х хао
6 (d X
Е Ы в а и 6 х о х и
1}
5 (X а.
x v х
6 Х
2 о а> х а 0 (а 6
PI
6 Х х
Х 6
t(, хх х (О,v
1 ((4 ((1 1
О -Х 1Д1
0!X 1(" .!
6aOX(d IО1
i6 Kx а!
Vi:XOX 1 Н1
I tO 6 X I» 5 O i>> I Х 1 ЕväвO(О1
ИООО21- >С1 >С оххйхих
I(I Х 6 0 I 1
ХО>4VХg((I
xx2xxox
I.e O (tI X 6 X W
i îxoaÅ !м
1 (." Х а> В Г., ИВХ аXo I
1 > О а ((> pj E
I 1 1 I I I
>-t H >4 ° H И Н (Г> Ю LA О LA Ю ((1 » » (Ч (Ч М m Г
9864 11
Таблица4
Морфологические, биохимические и физиологические показатели семени до замораживания
Предложенный способ Патент Великобритании охлаждения семени В 1479648
Показатель
221 6, 7
203+5у8
2022+15,2
69,0 1,3
2195+17,2
75+1,5
184+2,8+
7,5i0,06
16142,5
8к0+Ое08
Подвижность живчиков
ХХ-РС 0,01;.
Х -Рс 0,05.
Та блица 5
Результаты испытания предложенного способа ниэкотемпературного замораживания с применением ЛФРМГЖ среды
Опыт, В
Предлагаемый, способ
Показатель
Подвижность живчиков после оттаиванйя
4,75+0,09
Продолжительность жизни живчиков после оттаивания при 37 С, ч
8,8Ф0,34
Абсолютный показатель живучести живчиков после оттаивания при 37 С
30,2+1,2
Продолжительность жизни живчиков после оттаивания при +2-+4 С, 212,0+7,3
Абсолютный показатель живучести живчиков после оттаивания при +2-+4 С
602,6115,4
Состояние акросомы,живчиков г нормальной разрушенной
61,5 1, 2
38,5+1,2
Устойчивость белково-холестериновых комплексов, мкг холестерина на 10 живчиков
185
Оплодотворяемость коров от первого осеменения
67,5,60
Формула изобретения
Способ консервирования сперьи жи вотных, включающий ее разбавление беэглицериновой защитной средой, охлаждение, повторное разбавление спер- 65
Устойчивость белково-хслестериновых комплексов, мкг холестерина íà 10> живчиков
Устойчивость белково-фосфолипидных комплексов, мкгд фосфолипидов
Ф живчиков с нормальной акросомой
Активность глутаминоаспаргиновой трансаминазы в плазме семени мы защитной средой, содержащий глицерин,эквилибрацию с глицерином и замораживание,о т л и ч а ю щ н и с я тем, что, с целью повыаения жиэкеспособности и биологической полноценности спермотозоидов пс ле замораживания
986411
Составитель A Филиппова
Редактор О. Юркова Техред С. NHryHosa Корректор И. Ватрушкина
Тираж 71$> Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Заказ 10363/6
Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 и оттаивания, охлаждение спермы про« водят от +30 до +15 С со скоростью
0,4-0,5 С/мин, от +15 до +10 Ñ со скоростью 0,3-0,4 С/мин и от +10 до +4 С со скоростью 0,2-0,3 С/мин, зквилибрацию с глицерином проводят при +4-+5 С в течение 25-30 мин, а замораживание спермы проводят в па1 рах жидкого азота при температуре
-120 †140 в течение 8-8,5 мин.
Источники инФормации, принятые во внимание при экспертизе
1. Xhe French straw techniqui, 1976.
2. Патент Великобритании Н 1479648> кл. A 01 N 1/202, 1977 (прототип) . °
