Способ окрашивания нервной ткани

 

(72) Автор изобретения

В. B. Вшивцева

Ордена Трудового Красного Знамени йнотитут физиологии; им. И. П. Павлова. (7!) Заявитель

l (5O) СПОСОБ ОКРАШИВАНИЯ НЕРВНОЙ ТКАНИ

Изобретение относится к области меди- ° цины, а именно к гистологии.

Известен способ окрашивания нервной ткани метиленовым синии на фосфатном буфере путем погружения, нанесения и перфузии красящего раствора хлористого метиленового синего в изучаемый орган с последукицей фиксацией краски (1 ) .

Недостатком этого способа является затрудненная дифференцировка нервных окончаний от ркружающнх тканей.

Более совершенным является способ. окрашивания нервной ткани путем обработки ее строго изотоническим раствором метиленового синего в кислой среде прн рН ниже 7,0, основанный на том, что нервная ткань в кислой среде дольше других тканей удерживает метиловый синий. Он заключается в том, что слоям ный растеор при концентрации красите

as 0,01-0,035% доставляется в ткани с током крови в избыточном количестве для окраски всех тканей, а затем краси тель вымывается из нервных вканей

2 и оставшийся быстро фиксируется. Изотоничность создается хлористым натрием, постоянство рН.- 0,001 М раствором фосфатного буфера. Для лучшего выявле- . ния нервных структур в красяшую смесь

S, добавляют различные вещества — акцепторы водорода, а также глюкозу, пировинограднокислый натрий, соли магния.

Сложный красяший раствор (количество подбирается опытным цутем) под давле нием, близким .к артериальному, вжат

s артерии наркотизированного животного в течение 5-20 мин. Затем обнажа ют исследуемый участок, быстро вырезают и переносят в дифференцирукицую

М смесь - тот же раствор, но без краси» тела и под контролем микроскопа s течение 5-15 мин следят за исчезновением окпаски .нервных тканей до оптимальной степени яркости нервных элементов, после чего препарат немедленно погружают в фиксатор из смеси роданида аммония и пккрииовокисло}"о аммония f 2).

6861 4

10 нервных клеток и тканевых элементов

15 выявляются при определенных значениях рН. По максимуму интенсивности и полно25

3 98

К недостаткам способа отйосится лабильность окраски вследствие быстрого обесцвечивания, что затрудняет дифференцировку нервных волокон.

Целью изобретения является улучшение дифференцировки нервных окончаний от окружающих тканей.

Поставленная цель достигается тем, что при осуществлении способа окрашивания нервной ткани путем ее обработки метиленовой синью последнюю берут в концентрации 1 10 М вЂ” 3 10 М на

0,1-0,25 М фосфатном буфере, при этом в процессе обработки рН раствора пос» тепенно увеличивают от 4,5 до 7,0.

Способ осуществляют следующим образом.

Для окрашивания берут орган или кусочек органа только что забитого животного (мочевой пузырь лягушки, пищевод 20 белой мыши, тонкую кишку черепахи).

Лпплициру1от красящий раствор в условиях комнатной температуры (23-26 С).

Оптимальным является раствор, содержащий хлористый метиленовый синий (выпускаемый М сковским алкалоидным заводом, МВ-391) в концентрации 2,5 < 1O 5 М, растворенный 0,1»0,2 M фосфатным буфером. Значения рН раствора увеличивают от порции к порции от 4,5 до 7. В 265 опытах были. выявлены все типы нервных окончаний мочевого пузыря лягушки через 7 мин после начала аппликации раствора.

Для сведения к минимуму недостатков фиксации химическими веществами (выявление волокон соединительной ткани, перераспределение окраски, вымывание окраски при обезвоживании и др.) фиксируют окраску путем высушивания воздухом 10-15 мин.

Проверка опытным путем показала, что хорошие результаты получают при окрашивании раствором концентрации (1-3}х 10 М. Оптимальной концентрацией является 2,5х10 M. Более высокие концентрации наряду с нервной тканью интенсивно окрашивают и окружающие, а слишком высокие не позволяют выделить нервную ткань, закрашивая весь фон.

Низкая молярность раствора (0,01 М) вызь1вает варикозности, повреждения нервных волокон и прекращение их окраски, а также неравномерность окрашивания разных участков органа и ткани. ТочностГ: красящего раствора повидимому является одним из основных факторов удачной окраски и колеблется от 0,1 М до О,25 N.

Так О, 05-0,08 М вызывает неполную окраску нервных волокон и их окончаний мочевого пузыря лягушки, 0,2 М прекрасно выявляет нервные элементы, а

0,3-0 4 М дает постепенное ослабление окраски.

Подбор рН раствора осуществляют исходя из того, что все типы нервных волокон и их окончаний (рецепторы, преганглионарные волокна с синапсами, вегетативные волокна) наиболее полно и градуально выявляются при рН от 4,5 до 7,0. Разные типы нервных окончаний

I ты выявления тех или иных структур в условиях возрастания рН нервные элементы исследованных объектов располагаются в следующем порядке: рецепторы централь ного происхождения; безмякотные волокна с окончаниями; аксоны местных нейронов; преганглионарные волокна. Так, наиболее полная интенсивная избирательная окраска рецепторов мочевого пузыря лягушки наблюдается при рН=4,5-5,0; безмякотные волокна выявляются при рН 5,8-6,0; синапсы при рН=6,4-7,0.

У черепахи рецепторы центрального происхождения выявляются при рН=4,5-4,6; волокна и окончания вегетативного сплетения при. pH=B,8-6,6; аксоны местных нейронов при рН=6,2-6,4; дендриды при рН 6,9. В пищеводе белой мыши рецепторы выявляются при более высоком значении рН=5,9; моторйые бляшки при рН=6,2; синапсы при рН=6,2; волокна вегетативных сплетений при pH=6,0-6,2.

Это, однако, не означает, что. каждый тип нервных окончаний может быть; выявлен только при одном значении рН.

Че"ть окончаний выявляется и при других значениях. Окружающие ткани- фон тоже имеют рН вЂ” выявляемую характеристику, особенно, при рН выше 7,0. Поэтому метиленовый синий апплицируют порциями, равномерно повышая рН от 4,5 до 7,0.

Предлагается оптимальное окрашивание при температуре 26 С. Проверка

У влияния различных температур показала, что низкие температуры (4.-17 С) замедляют окрашивание, в то время как высокие (3742 С) у холоднокровных (лягушки) ускоряют ее, но одновременно вызывают неравномерную окраску. участками. Для теплокровных (пищевод белой мыши",золотистого хомичка) также не

5 9868 рекомендуется температура окрашивания выше 35 С.

После интенсивного выявления всех типов нервных окончаний через 7-15 мин от начала окрашивания (при этом продолжительность зависит от толщины препарата и плотности ткани) удаляют избыток раствора и сушат препарат до,.полного высыхания оптимально при температуре 25-30 С в течение 10 15 мин на воз- 10 духе. В результате такого высушивания метиленовый синий химически не изменяется, сохраняя при этом все оттенки цвета, присущие окраски in чача. При . высоких температурах начинается разло. жение метиленового синего. Однако более толстые препараты можно сушить на устройстве для парафиновых срезов в термостате при 37-42оС Если препарат высушен не до конца, он со временем2о обесцвечивается. Поэтому полное высушивание препарата необходимо. Краситель гигроскопичен и при этом способен к обесцвечиванию под действием света.

После высушивания следует обычное ироо- ветление ксилолом и заключение в даммарову смолу.

Существенна свежесть материала, так как примерно через 1-1,5 ч переживания энергетический уровень обмена в Эй ткани падает.

Пример 1. Мочевой пузырь лягушки. Мочевой пузырь разрезают в области лопастей, чтобы ригидное кольцо шейки д было сохранено,и осторожно расправляют на предметном стекле. -Прикрепив края разреза к стеклу (во избежание сокращений при окрашивании) апплицируют красящий раствор порциями, равномер-4я но повышая рН от 4,5 до 7,0, в течение 7 мин (лучше в затененных условиях) затем осторожно (промокательной бума ° гой) удаляют избыток краски и 1015 мин сушат на воздухе (25-30 С). †. После этого просветляют в ксилоле и заключают в даммарову смолу.

Пример 2. Тонкая кишка черепахи. Участок неразрезанной кишки, расправленный рамочкой, трубочкой, заполнением м или закреплением иглами окрашивают также как и мочевой пузырь лягушки, но удлиняют время аппликации красителя до 15. мин. а сушку до 20-30 мин. Перед сушкой разрезают отделяют от слизистой обО» SS лочки (так как она способствует обеоцвечиванию окраски и замедляет высушивание) и осторожно расправляют на предметном стекле.

61 6

Пример 3. Пищевод белой мыши, золотистого хомячка. Пищевод окрашивают 7 мин в расправленном состоянии (одетым на рамочку, трубочку, заполненный или закрепленный на конпах во избежание сокрашения), не разрезам также как: и мочевой пузырь лягушки.

Затем разрезают,. отделяют от слизистой оболочки, расправляют на предметном толике, сушат 20-30 мин; просвет ляют и заключают. :

Во всех случаях выявляются нервные окончания. Раствор красителя: 10 мл

0,2 М фосфатного буфера (а для тонкой кишки черепахи 0,1 М) порциями рН от 4,5 до 7,0 и 1 мг хлористого м тиленового синего.

Преимушества описываемого способа в обеспечении 100 -ного выхода качественных препаратов, простоте методики, сокращении времени окрашивания, стабильности результатов, исключении вредного воздействия света, так как отпадает необходимость ь микроскопировании. Ðàñпределение красителя в препарате coor ветствует прижизненному,а также ликвидируется возможность выявления волокон соединительной ткани, вызванная фиксацией и затрудняющая дифференцировку нервных волокон. Обеспечиваются стабильные условия выявления нервных оконча- ний всех типов, получена возможность предотвращения обеспвечивания метилено- . вого синего. Все вышеперечисленное дает возможность исследования окраски, полностью соответствующей прижизненной, что особенно важно для проведения качественной и количественной обработки материала. Кроме того, за счет исклю»

I чения фиксации молибденовокислым аммением и обезвоживания проводкой через абсолютный этиловый спирт значительно сокращается время процесса и отпадает необходимость в реахтивах.

Формула изобретения. Способ окрашивания нервной ткани путем ее обработки метиленовой синью, отличающийся тем, что, с целью улучшения дифференцировки нерв ных окончаний от окружающих тканей, метиленовую синь берут в концентрации

1х10 э М - 3 «10 М на 0,1-0,25 М фосфатном буфере, при этом в пропессе абработки рН раствора постепенно увеличивают от 4,5 до 7,0.. M8M1

7, Источники информапии, принятые во внимание при экспертизе

1. Лилли P. Патогистологическая темника и практическая гистокимия, М., "Мир, 1969, с. 57 .-57З.

2. Шабадаш А, Л. Теория и практика прижизненной окраски нервной системы метилеиовым синим.

Горький, "Медипииа, 1939, с. 44 (прототип).

Составитель Д. Соловьев

Редактор. Г. Прусова Текред И.Гайду; Корректор А Пзятко

Заказ 10428/28 Тираж 871 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР ао делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП «Ihrrsitr г. Ужгород, ул. Проектная, 4