Способ получения антибиологического комплекса,обладающего противоопухолевой активностью

 

ИЗО ТЕИИЯ

Синев Севетскии

Сецналистическик

Реслублик

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту(22) Заявлемо 0),0480 (21) 2906901/28-1 (51)М. т(л.з

С 12 P 1/06 (23) Ориоритет - (32) 0?„04.79

Государствеииий комитет

СССР ио аелаи изобретеиий и откритий (31) 026488 (33) СШ

Опубликовано 23028З Бюллетень Но 7 (53) УДК 615. 779. .931(088.8) Дата опубликования описания 230283

Иностранцы

Хидео Косияма, Фумихиде Сакаи и )/gpss ages,Окуман (Япония)

Е,,., ", с

Иностранная фирма

Бристоль Мейерз Компани (CtQA) (72) Авторы, изобретеиия (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА, ОБЛАЛАЮШЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к области .микробиологии и касается способа получения антибиотического комплекса, обладающего противоопухолевой активностью 5

Известен микробиологический способ получения антибиотика хиномнцина, относящегося в структурном отношении к хиноксалиновой группе ан тибиотиков 1).

Целью изобретения является получение антибиотического комплекса, обладающего противоопухолевой активностью.

Поставленная цель достигается 15 тем, что согласно способу получения антибиотического комплекса, обладающего противоопухолевой активностью, отличием является то, что штамм

Actinomadura sp. G — 455 - 101 вы- Я ращивают в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода и азота в аэробных глубинных условиях с последующим выделением антибиотического комплекса и/или разделением 25 его на компоненты А, В, С, D, Е, F.

Штамм Actinomadbra sp. G-455-101 выделен иэ образца почвы, собранной на Филлипинских островах, депонирован в Американской коллекции культур 3Q ми кроор гани змов (АТСС) под номером

ATCC 3 1491-и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Штамм G-455-101 образует субстратный и воздушный мицелий. Субстратный мицелий хорошо развит, длинный и разветвленный (0,5-0,8 м вширину ).

Отчетливая фрагментация субстратно-, го мицелия не видна. Воздушный мицелий короткий или рудиментарный, в некоторых агаровых средах не обра- зуется вообще. В воздушном мицелйи образуются короткие или длинные спороносные цепи, которые содержат

2-50 овальных спор в цени (главным образом 5-20 спор). Спороносные цени прямые, извилистые или петлеобраэные по виду. Споры сферические (0,30,4 м), овальные нли цилиндрические (0,3-1,5-3,0 м) по виду и имеют гладкую поверхность. Споры частот отделяются с помощью пустых гифов.

Иногда на воздушном мицелии образуется аморфный спорангио-образный пузырек, из которого развивается короткая змееобразная спороносная цепь.

Клеточная стенка штамма С--455-101 содержит меэодиамииЬпимелкновую ки 999981 слоту, но не содержит глицин. При гидролиэе целой клетки обнаружено .присутствие глюкозы, маннозы и маду. .розы (3-0-метил-D-галактозы).

Культуральиые и физиологические свойства.

Штамм G-455-101 растет обильно, образует розовый или серовато-розовый воздушный мицелий и дает красноватый не растворимый в воде пигмент на богатой питательными веществами агаровой среде, такой как агар с

;дрожжевым экстрактом и солодбвым экстрактом и агар с овсяной мукой.

Однако на средах, таких как неорганические соли — крахмальный агар, глйцерин-аспарагиновый агар и тирозиновый агар -.штамм дает плохой рост, образует белый.или бежевый. рудиментарный воздушный мицелий и дает небольшое количество красноватого пигмента. Иеланоидный пигмент не продуцируется на пептондрожжевомжелезном агаре и тирозиновом агаре.

Растет обильно при 28оС 27 С и

45 С но не растет при 10 С или 50 С.

Агар Чапека. Рост ограниченный или отсутствует. Субстратный мицелий (обратная сторона) темно-розовый.

Воздушный мицелий белый до бледнорозового.

Растворимый пигмент отсутствует.

Бульон триптон-дрожжевой экстракт.

Рост умеренный, хлопковидно-опущенный, седиментированный и непигмен;тированный.

Агар с дрожжевым и солодовым экстрактом. Рост обильный. Субстратный мицелий (обратная сторона) темно-красный до красновато-коричневого

Воздушный мицелий обильный;серовато-розовый до пурпурно-розового, растворимый пигмент отсутствует.

Овсяный агар. Рост обильный. Обратная сторона субстратного мицелия интенсивно желтовато-красная. Воздушный мицелий умеренный, розовый, растворимый пигмент оеровато-желтый.

Неорганические соли — крахмальный агар. Рост плохой. Обратная сторона субстратного мицелия слегка желтоватокоричневая до темно-красного.

Воздушный мицелий ограниченный, белый,до бежевого, растворимый пигмент отсутствует..Глицерин-аспарагиновый агар. Рост плохой. Обратная сторона субстратного мицелия желтовато-розовая до, красновато-коричневого. Воздушный мицелий ограниченный, белый, растворимый пигмент отсутствует.

Пептон-дрожжевой экстракт — желез ный агар. Рост плохой, складчатый.

Обратная сторона мицелия интенсивно красновато-оранжевая. Воздушный мицелий отсутствует, растворимый пиг мент слегка желтовато-оранжевый

Тирозиновий агар. Рост плохой.

Обратная сторона субстратного мицелия темно-красная. Воздушный мицелий,: ограниченный белый, растворимый пиг мент отсутствует.

Глюкозо-аммониево-солевой агар.

Рост плохой. Обратная сторона субстратного мицелия красновато-коричневая. Воздушный мицелий ограниченный, светло-серый, растворимый пиг10. мент отсутствует.

Агар Беннет а. Рост умеренный.

Обратная сторона субстратного мицелия красновато-коричневая. Воздушный мицелий ограниченный серовато15 розовый, растворимый пигмент отсутствует. (Культуральные признаки наблюдав ются после инкубации при 37 С в течение 3-х недель).

Биохимические свойства.

Нитрат и нитриты восстанавливают казеин в агаровой среде гидролизует слабо. Снятое молоко коагулирует.

Желатин не разжижает. Сероводород иэ

Z-цистеина образует. Меланоиды не

25 г.,:образует. Реакция на каталазу,положительная, реакция на оксидазц положительная.

Хорошо утилизирует глицерин, D-ксилоэу, D-рибозу, Z-рамнозу, D-галактозу, D-g>pyzxoay, D-маннозу, D-маннит, усваивает D(-)-арабинозу, 7.(+)-арабиноэу, D-глюкозу, целлобиоэу, трегалозу, растворимый крахмал, инозит, целлюлозу, хитин, кератин, 35 очень слабо утилизирует лактозу, мелибиозу (на среде Придхэм — Готтлиба с добавкой 0,1Ъ дрожжевого экстракта, не усваивает Е(-)-сорбоэу, сахарозу, рафинозу, D(-)-мелецитозу, 40 дульцит, D-сорбит, салицин.

Способ осуществляется следующим образом.

Для получения противоопухолевого антибиотического комплекса ВВМ-928

45 штамм актиномицет G-455-101 культивируют в водной среде, содержащей ассимилируемые источники углерода и азота в условиях аэробного погружения до накопления максимальной ан50 тибиотической активности.

В качестве источника углерода в состав среды могут быть использованы крахмал, глюкоза, декстрин, мальтоза, лактоза, сахароза, фруктоза, манноза, мелассы, глицерин и другие. В качестве источника азота можно использовать протеин, белковый гидролизат, полипептиды, аминокислоты, жидкость от замочки зерна, казеин, мочевина и другие, а в качестве минеральных солей в состав питательной среды могут входить анионы и катионы, такие как калиевые, натриевые, аммониевые, кальциевые, сульфатные, карбонатные, фосфатные, хло65 ридные, нитратные и другие.

999981

Компонент

ВВМ-928А

О 71

0,48

ВВМ-928В

0,53

0,26.ВВМ-928С

ВВМ-9280

0,27

0,07

0,73

0,53

Культивирование можно осуществлять при 20-45оС, оптимальная температура культивирования 28-34 С, предпочтительней 30/32 C.

Максимальное накопление антибиотика обычно достигается примерно на 4-6 сут,культивирования . Культивирование осуществляют в условиях аэрации и перемешивания. При необхо- димости можно вводить пеногасители, такие,как силиконовое масло, соевое масло и лярд.

Антибиотическую активность .определяют с помощью агародиффузионного анализа на бумажном диске с использованием в качестве тест-культуры

Sarcina 1utea, рН 9,0.

Комплекс ВВМ-928 выделяют из .ферментационного бульона с помощью обычных средств, например, путем экстракции растворителем очистку осуществляют препаративным противоточным распределением и хроматографически.

Пример 1. Получение комплекса ВВМ-928. Агаровая фермен« .тация. Хорошо выросший агаровый косяк urrameaActieovnadura species

G-455-101 используют для инокуляции вегетативной среды, содержащей 2% ,растворимого крахмала, 1% глюкозы, О, 5% фармамедия (фармацевтическая средами, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% NZ-амина (тип A) и 0,1% карбоната кальция, при. этом рН доводят до 7,2:перед стерилизацией.

Посевную культуру инкубируют при

32 С s течение 72 ч на вращающемся встряхйвателе (250 об/мин), и 5 мл ростовой культуры переносят в 500 мл колбу Эрленмейера, содержащую 100 мл ферментационной среды, состоящей из

2%"растворимого крахмала, 1% фармаИасреды, 0,003% ZnS04 ?Н<0 и 0,4% карбоната кальция.

Максимальное накопление комплекса

ВВМ-928 обычно достигается примерно после 5-дневного встряхивания культуPBб

Ферментация в танке. Посевную куль туру встряхивают в течение 4 дней в колбах Эрленмейера и инокулируют в

100 л среды для прорастания, состоящий иэ 2,0% овсяной муки (фирмы

Квакер Продактс. Австрия), 0,5% глюкозы, 0,2% сухих дрожжей, 0,0008%

MnC1ó. 4На0 0,0007% CuS04 ?И О, 0,0002% ZnS0g ?Н О и 0,0001% FeS04

?Й О в 200-литровом танковом ферменторе для посева, в котором осуществляют перемешивание при 200 оборотах в мин при 30 С в течение 54 ч..

15-литровую порцию посевной культуры затем инокулируют в 170 л ферментационной среды, содержащей 2,0% растворимого крахмала, 1,0% фармасреды

0,003% гептагидрата сульфата цинка и

0,4% карбоната кальция в 400-литровом танковом ферменторе, который работает при 30 С при 200 оборотах в минуту при скоростиаэрирования 150л/мин.

Величина рН бульона постепенно увеличивается по мере прохождения процесса ферментации и достигает 8,4-8,5 спустя 100-120 ч, при этом за этот период времени достигается пик антибиотической величины равный 30 мкг/мл.

Пример 2. Выделение комплекса BBM-928 экстракцней растворителем.

Собранный бульон (170 л, рН 8,5) по примеру 1 фильтруют с осветля сщим агентом. Находят активность как в мицелиальном осадке на фильтре, так и в фильтрате. Мицелиальный осадок экстрагируют дважды растворителем, представлякщим смесь ацетона и метанола (1:1, 30 л х 2). Экстракты объ35 единяют и упаривают при пониженном давлении, получая водный концентрат, который экстрагируют н-бутанолом.

Бульонный фильтрат экстрагируют дваж ды н-бутанолом (40 л х 2). Концентрирование объединенных H-бутанольных экстрактов при пониженном давлении и лиофилизация остатка дает неочищенное твердое вещество (21,4 г). Согласно данным анализа тонкослойной

45 хроматографии данный материал представляет собой комплекс, состоящий из трех главных компонентов, А, В и

С, и трех второстепенных компонентов

D, Е и F, имеющих величины Rf, представленные в табл. 1.

Таблица 1 б

9"9981

Продолжение табл.1

Компонент

ВВМ-928Е

ВВМ-928F

0,34

0,56

0,17

0,39

Обнаружение с помощью УФ развертывателя хХ(симадзу С-910) при 345 см.

„„„ н-Бутанол-метанол-вода (63: 27:10).

Ксилол-метилэтилкетон-метанол (5:5:1). б5

Пример 3. Очистка комплекса

ВВМ-928.

Неочищенный комплекс, полученный. по примеру 2, очищают с помощью устройства для препаративного противопоточного распределения (Митамура, 100 мл/трубку) с использованием системы растворителей: четыреххлористый 25 углерод-хлороформ-метанол-вода (5:2:5-1). После 50 переносов содержимое трубок 5-20 объединяют, получая бледно-желтый порошок (4,4 г), содержащий компоненты А, В, D, Е и F. 30

Данную смесь растворяют в небольшом количестве хлороформа и пропускают через колонку из силикагеля С-200 (500 мп), которая предварительно пропитывается этилацетатом. Колонку 35 проявляют этилацетатом с увеличивающимся количеством метанола (2-5Ъ, объем/объем) и фракции дозируются по оптической плотности при 345 нм, Первым элюируется этилацетатном вторич 40 ный компонент D, а затем компонент А.

Компоненты Е, В и F элюируются следующими в указанном порядке при концентрации метанола ЗЪ. Каждую фракцию, содержащую соответствующий компонент, упаривают при пониженном 45 давлении, и остаток кристаллизуют смесью хлороформа и метанола. Аналогичным образом сырой препарат компонента получают из трубок 21-35 при вышеописанном противопоточном рас- 50 пределении. Очистку компонента С осуществляют с помощью хроматографии на силикагеле и кристаллизации из хлороформа-метанола.

Выходы компонентов A,В, С, D, Е 55 и Г составляют соответственно 988 мг, 420 мг, 848 мг, 130 мг, 119 мг и

114 мг.

Пример 4. Дополнительная очистка компонента ВВМ-928 А примера 3.

Анализ тонкослойной хроматографии компонента ВВМ-928 A примера 3 (c применением систеж, состоящей . йз 10% метанола в толуоле) показал, что образец не был. полностью гомогенным в. связи с тем, что он содержит дополнительный материал, идущий непосредственно перед компонентом

BBM-928 A. Для достижения очистки осуществляют следующие стадии.

Стадия 1. Образец хроматографируют на силикагеле с использованием линейного градиента хлороформа до 6% метанол-хлороформ. Фракции, элюирующие между 2,4 и Ç,ЗЪ метанола-хлороформа (содержащие компонент

BBM-928 А плюс какую-то примесь) направляются на следующую стадию.

Стадия 2. Создается вогнутый градиент с использованием трех сосудов, из которых в первых двух содержится 2В метанол-толуол, а в третьем

6% метанол-толуол. Состав из стадии 1, хроматографированный (колонка из силикагеля) на данном градиенте, дает второстепенный компонент, который элюируется первым, с после- дующим элюированием почти сразу за ним очищенного компонента BBM-928 A (упоминаемого здесь как BBM-928 A р) i

Молекулярный sec ВВМ-928 р, определенный с помощью Полесой ДесорбIIBoHHoA Масс спектрометрии, состав-, ляет 1427 что соответствует эмпиР««« ФоРмУле >4 И7ВЦИ 0 4 (МВ 1427, 417) .

Элементный анализ (образцы, высушенные при 100 >С в течение 18 ч):

Найдено (среднее от трех определений), %: С 53,85; Н 5,51, N 13,74, 0 (по. разнице) 26,90.

С64 Н ВИИ 0 4

Вычислено, %: С 52,47; Н 5,48, N 13,81, 0 (по .разнице) 28,24.

Физико-химические свойства компонентов BBM-928 А, В, С и -D.

Индивидуальные компоненты BBM-928 показывают растворимость и реакции окрашивания сходные друг с другом.

Например, они легко растворимы в хлороформе и иетиленхлориде, слегка

999981 тельные реакции с реактивами Толленса, Сакагучи и нингидрином.

Характерные физико-химические свойства компонентов ВВМ-928 показаны в табл. 2.

Таблица 2

Свойства

Точка плавления,о С

224-227

246-248

21 4-217

244-248

Ы (c 1,cHclç) -74

-27

-13.

Анализ, найдено г

53,19

50,75

50,14

51,77

5,25

5,40

5,29

5,29

13,55

12,58

12,34

12,92 по разнице (Е 1%

Л„ в н 1 ) 31,42

235 (550)

264(380)

345 (155) в этиловом спирте

234(565)

264(405) в этиловом спирте. НС1

345(165) в этиловом спиртегидроокиси натрия

230(650)

256(930) 330(140)

383(145) 1,470

4 молярных эквивалента ацетильных групп. Три продукта ацетилирования, полученные таким образом, обнаруживали идентичные свойства по данным

ТСХ, УФ, ИК и ЯМР спектров, что указывает на то, что ВВМ-928 A является моноацетильным производным компонента BBM-928 В и диацетильным производным ВВМ-928 С.

Кислотный гидролиз ВВМ-928 A давал пять растворимых в н-бутаноле растворимы, в бензоле, этаноле, метаноле и н-бутаноле и- нерастворимы в воде и н-гексане. Положительные реакции получаются с хлорным железом и -реактивами Эрлиха, а отрица28,49

235 (586)

264 (415)

345 (165)

234(610)

264(410)

345(165)

230(564)

256(763)

330(180)

383(170) Молекулярный вес (Эосмометр, в СЯСЬ )- 1,450

Спектры ЯРМ.ВВИ-928 А, ВВМ-928 B и рВМ-928 С очень сходны друг с дру, гом, при этом единственная разница заключается в присутствии ацетильных групп в компонентах А0(:2,03 миллионных долей, 2 мол,эквивалента) 60 и В (Кв2,05 млн.долей, 1 мол.эквивалент), но не в С. С помощью ацетилирования уксусным ангидридом в пиридине .в компоненты BBM-928 A, B и С вводятся соответственно 2,3 и 5

32,23

235(570)

264(400)

345(163)

234(556)

264(446)

349(188)

230(530)

256(775)

330(116)

383(122) 29,39

235(638)

264 (442)

345(173)

234(650)

264(442)

345(173)

230(580)

256(704) . 330(117)

383(122) 999981

НПВ-1

НПВ-2

НПВ-3

НПВ-4

НПВ-5

0,72

0,49

0,46

0,45

0,23

Идентификация сн0 0И

СΠ— (ЯРЯ-5) BIO 0Н

ЮЛИ

Фрагмент У

ИС Сн 1Г

С- ОН

5 0- cO- cH-Ф- сО -си ин

f. 21 ! СН Си Сн

I со- ин- сн- со н

1У, Сер.

1У, Сер, HN-Вал

1, НМ-val

1У

У 1, НМ-val.Sar

-ser Серии

НМ-va3 р-Окси-Ы-метилвалин

Саркозин

sar

УФ-поглощающих фрагментов (Ч . П, И, 1У, и У).и пять растворимых в воде нингидрин-положительных веществ

НПВ-1, 2, 3, 4, н 5 . Последние вещества разделяются с помощью хроматографии на Дауэкс 50х4 и идентифицируются как следующие аминокислоты:

Соединения Rf ($-1?8) р --Окси-Й-мвтилвалин(Н„„ - УсЮ )

Глицин(Гли)цЬу

Серии(зег)

Саркозин(сар) (не идентифицирована)

"ТСХ, силикагельная пластинка.

S-123-10% ацетат аммония-метанол

10%-ный раствор аммиака (9:10:1).

Показано, что пять УФ-поглощающих фрагментов> упоминаемых выше, имеют следующие структуры: Фрагмент 1.

С 4 Н,4 Og, МС: mje 306(Ц )

Лмакс 227, 233, 251, 345 нм.! си о,, с и со-ви-си-со и

Нри кислотном гидролиэе (6Н НС1)

Фрагменты 1, П, Ш и У давали следу

Фрагмент П

С„Н2, О

МС: и/е 377(М +58) меон

Л 229, 234, 261, 345 йм.

5 мак си

ИН 0Н

I йи g-со-сн с(сиу

1О и со-ин-сн-го и

Фрагмент Ш м, 230, 235, 262, 345 им, Фрагмент 1У

С„ Н, NOy

МС: м/е 205(М -)

25 меОИ

Д. „ 228, 260, 354 нм. мсяс

С в Н Х40

230, 235, 262, 345 нм. ющие продукты разложения, приведенные в табл.З

13

999981.СН 0 0Н .г с05еъ 1 - уЕф ю а йм — йа В

Фрагмент 1У. 30

Обработка фрагмента У1 0,1 н. НС1 при 110 С в течение 1 ч дает фрагмент УП плюс HM-val представленный следующей тетрагидро-. пиридазиновоЧ структурой 20

СИ

3 г

l со е OR

-уРу, а -нм-чаГ

HO осн

0 .О

«уе СО

HN ЧОР- 30%- - %g С.R4. R2

Активность индукции пробактериоФага определяется для компонентов

BBM-928 на лизогенной бактерии (1LB)

До концентрации 100 мг/мл в случае компонентов BBM-928 А, В и С не было продемонстрировано никакой значительной 1ЬВ активности.

Нротивоопухолевая актив ность .

Сравнительные испытания компонентов A В, С и Р BBM-928 с митомицином С на противоопухолевую активность осуществляется с интраперитонал но имплантированными опухолями: P388: лейкемия, Ь 1210 лейкемия, В16 мела нома, легочная карционома Льюиса (3lJI) и саркомный асцит 180 (S180) .

Испытываемые растворы компонентов

BBM-928 в 0,9В-ном физиологическом растворе, содержащем 10% диметилсульфоксида, и митомицина С в

0,93-ном физиологического раствора вводились раз в день в соответствии с.дозировочным графиком, изменяющим ся от обработки единичной дозой в день до многократного ежедневного лечения. С помощью варьирования до зировок определяется минимальная эффективная доза (ИЭД), которая дает среднюю величину времени вы живания по крайней мере в 1,25 раза большую, чем контрольная группа.

ser серин

gly глицин

sar саркозин

ВВИ-928, Ас,Ас

ВВМ-928В Ас Н НМ-val -окси-N-метил- 40 валин

ВВМ-928С H Н

Антимикробная активность.

Антимикробная активность компо- 45 нентов ВВМ-928 определяется по отношению к множеству бактерий и гриб» ков по методу серийного разбавления агара на питательном агаре при рН

7 с использованием мульти-инокулирующего устройства Стиир а. Размер инокулюма стандартизирован для при.менения 0,0025 мп количества испытываемых организмов, содержащего приблизительно 10" клеток-мл для всех бактерий и грибков, эа исключением кислоустойчивых бактерий, для которых используется 10 клеток/мл.

Минимальную !ингибирующую концентрацию. (ИИК ), определяют после инкубирования в течение ночи при 37 С ° ВВМ-928 60 компоненты являются от умеренно до слабо активными против грамположительных и кислотно-голодающих бакте-. рий, но практически неактивны против грам-отрицательныхбактерийи грибов 5

Ридролиз BBM-928 A или BBM-928 С с помощью 0,1 нОм, гидроокиси натрия при 25 C в течение 3 ч дает фрагмент У1 (сокращения ser, НМ-val О

СОЧЕЧХ&Гуьа и sar имеют значения, укаэанные выше. и gly представляет глицин, а символ Х представляет неидентифицированную часть.

На основании результатов вышеописанных опытов по разложению, спектральных данных, микроанализа и определений молекулярного веса, считается, что следующие структуры наилучшим образом представляют

ВВМ-928 A В и С

999981

Формула изобретения

Составитель Г. Смирнова

Редактор Г.Волкова Хехред Т,Фанта КорректорИ. Ватрушкина

Заказ 1189/80 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Считается, что эта степень активности является мерой значительной противоопухолевой активности. ВВМ-928 A является заметно более активным, чем миномнцин С, прн этом фактор увеличения составляет 10-300 в зависимости от штамма опухоли и доэировочного графика. Интраперитональные величины JfDyo компонентов

ВВМ-928 А, В, С и D и митомицина С определены по,методу Ван дер Вэрдан а 1О

Arch.Expt.path,pharmak 195, 389 (1940), Предложенный способ позволяет получить новый антибиотиче кий комплекс, обладающий высокой противоопухолевой активностью.

Способ получения антнбиотического комплекса, обладающего противоопухолевой активностью, о т л и ч а юшийся тем, что штамм Actinomadura sp. G -445-101 выращивают в жид. кой питательной среде, содержащей источники углерода и азота в аэробных глубинных условиях с последующий выделением антибиотического комплекса и/или разделением его на компо-. ненты А, В, CD Е и F.

Йсточники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Shoji, et al. G.Antibiotics, 14А, 335, 1961.