Способ получения иммуносорбента

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ HfWHG СОРБЕНТА пУтём связывания антигена с носителем, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения стабильности ,. в качестве антигена используютфосфолипидный антиген и связывание осуи ствляют обработкой носителя смесью раствора антигена в хлороформе и 0,5±0,01% раствора полиметилметакрилата в хлороформе при объемном соотношении носителя и указанной смеси 1:1 с последующим высушиванием пояученнопо продукта. 2,Способ по п, 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что используют фосфолипидные антигены риккетсий или хламидий.. 3.Способ по п, 1, о т л и ч а юV ) щ и и с я тем, что в качестве носителя используют полиакриламидный гель или растворивши крахмал, или сефароЗУ 4В.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„ЯЯ„„1007676

А g А 61 К 47/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ /;

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ . 4

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И 07НРЫТ1Ф (2l) 3294646/28-13 (22) 30,03.81 (46) 30.03.83. Бюл. и 12 (53) -543;88(088.8) (72) A. В. Тупицын, О. А. Тимашева и

Э. С. Горовиц (71) Пермский государственный медицинский институт и.Пермский ордена

Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт. вакцин и сывороток (56) 1; Авторское свидетельство СССР 651814, >en. а 61 К 47/00;,1977.

2; Хавкин 6. А., Булыгин Н. Г. Биоспецифическая аффинная сорбция и его применение в иимунологии. Уфа, 1978, с. 3-16.

3. Volkert, Christens.en. Acta. path. ей. в1.сгоЬ!о1. Scandinav., 1955,37>

И2, 211 218

j (54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИИИУНОСОРБЕНТА путем связывания антигена с носителем, о т л и ч а-ю tti. и " с в тем, что, с целью повышения стабиль- ности,, в качестве антигена используют фосфолипидный антиген и связывание осуществляют обработкой носителя смесью раствора антигена в xnhpoформе и 0,5+0,013 раствора полиметилметакрилата в хлороформе при объем" нои соотношении носителя и -указанной сиеси 1:1 с последующим высушиванием полученного продукта.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю- шийся тем, что используют фос" фолипидные антигвны риккетсий или хламидий.

3. Способ по и, 1, о т л и ч а юшийся тем, что в кайестве носителя используют полиакриламидный гель или растворииый крахиал, или..сефарозу 4В. 6

0 676 ) 10

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской чикроЬиологии и может быть использовано для выделения специфических антител, применяе- . мых в диагностике ряда инфекционных заболеваний, Известен способ получения иммуносорбента путем обработки кремнийсодержащего .неорганического носителя у-аминопропилтриэтоксисиланом, модификации полученного носителя глутаровым альдегидом с последующим ковалентным связыванием его с белком. Иммуносорбент применяется для выделения чистых антител из сыворотки (1 ).

Однако кратность использования иммуносорбента составляет 5-8.

Известен способ получения иммуносорЬента путем включения антигена в полиакриламидный гель проведением совместной полимеризации акрильных мономеров с общей концентрацией их до 121 в присутствии антигена и инициаторов полимеризации с последующей дополнительной сшивкой предварительно фиксированного актигена глутаровым альдегидом. Вводимый в гель актиген в данном случае используют в виде следующего комплекса - дифтерийный токсин- анти гоксин из нативной культуральной жидкости дифтерийной палочки и нативной противодифтерийной сыворотки (2 ).

Однако способ не обеспечивает высокой стабильности получаемых иммуносорбентов. В процессе использования после 10-1) кратного использования значительно снижается их специфическая активность, что связано как с ухудшением колоночных свойств инертного носителя, так и недостаточно прочной фиксацией на нем антигена.

Цель изоЬретения — повышение стаЬильности получаемого иммуносор, Ьента.

Поставленная цель достигается способам получения иммуносорЬента путем связывания с носителем, где в качестве антигена используют фосФолипидный антиген и связывание осуществляют obpàáîòêîé носителя смесью раствора антигена в хлоФорме и 0,5+0„01, -го раствора полиметилакрилата в хлороформе при объемном соотношении носителя и указанной смеси 1 1 с последующим высушиванием полученного продукта.

it

26

2 ) Ф

/ Ф

Я)

2

Предпочтительно используют Фосфоли пидные анти гены ри ккетсий или хламидий, В качестве носителя обычно используют полиакриламидный гель, или растворимый крахмал, или сефарозу

4В.

Способность Фосфолипидных антигенов растворяться в хлороформе, не меняя своей специфической активности, дает возможность иммобилизовать их на носителе с помощью растворенного в хлороформе полиметилметакрилата (плексигласа). 8 результате достигается не только прочная фиксация антигена на носителе, но и за счет плексигласа значительно улучшаются колоночные свойства инертного носителя- увеличивается его стабильность. Кратность использования до 5).ргэ. В качестве исходного материала для извлечения фосфолипидных антигеков используют желточкые мешки куриных эмЬрионов, инфицированных соотве-;ствующими микробными штаммами, ! например, возЬудителем сыпного тифа риккетсиями Провачека. Желточные мешки гомогекизир ют и из гомогената извлекают антигек по известной методике ь3 ).

Пример 1. Приготовленный антигек растворяют в хлороформе из рас чета I мл на 1 желточный мешок. После чего его смешивают с равным объемом 0,54 раствора плексигпаса в хлороформе. Ранее готовят полиакрил амидный гель (50 мл). С этой целью

N„й - метилек-Ьис-акриламид 1,625 г растворяют в 25 мл дистиллированной воды при 40вС в течение 0 мин, К полученному раствору добавляют

2,5 г акриламида, затем последовательно вносят инициаторы сополимеризации: 0,05 г персульфата аммония и

0,25 мл 101 раствора на дистиллированной воде N, N, N и - тетраметилI этилендиамина, Приготовленный полиакриламидный гель измельчают, просеивая через капроновое сито, промывают ацетоном и хлороформом, Затем к однсму объему носителя - полиакриламидному гелю доЬавляют равный объем полученной смеси антигенплексиглас„ тщательно перемешивают и высушивают в токе воздуха до исчезновения запаха растворителя. ПолУченный иммуносорЬект используют для выделения антител к риккетсиям Провачека (пример 2). Аналогичным ОЬра7676 ф ние 30 мин. После .полного отмывания физиологическим раствором рН 7,0 несвязавшегося белка, сорбированные антитела элюируют. Элюцию проводят одним из общепринятых способов, в частности 0,1М буферным раствором

КС1 - глицина при рН 2,5 с последующей нейтрализацией раствора.

Выделенные "чистые" антитела к

tD риккетсиям Провачека обладают высокой удельной специфической активностью.

Коэффициент очистки составляет 44,5. При этом Ьедок определяют на спектрофотометре Сф-16, à ГЕ (гемогглвтини15 рующая единица) определяют в реакции непрямой гемогглютинации.

Т а б л и ц а 1

Содержание белка в мг

Удельная активность

ГЕ на мг белка

Коэффициент очистки (отношение удельной активности

"чистых" антител к удельной активности исходной сыворотки) Специфическая активность в

ГЕ хмл, Исходная . сыворотка

25,6

160

4096

Сыворотка после иммуносорбции

1,984

157,2

312

Выделенные

"чистые" ан1,924

44,5

2192

1139,3 титела

Пример 3. Получение иммуносорбента для выделения чистых антител к риккетсиям Музера, Исходным материалом для получе-, ния фосфолипидного антигена служат инфицированные риккетсиями Музера штамм "Исаханян" желточные оЬолоч/ ки куриных эмбрионов -(титр возЬудите- ля 10, ПД -. 0,2 мл при введении в желточный мешок Желточные оЬолочки гомогенизируют и из гомогена извлекают антиген по методу (3 ). Полученный антиген растворяют в хлороформе из расчета 1 мл на 1 желточный мешок.

Затем его смешивают с равным объемом

0,54 раствора плексигласа в хлороформе. Ранее готовят полиакриламидный гель, как описано выше. Приготов- >5 ленный полиакриламидный гель измельйают, просеивая через капроновое сито, промывают ацетоном и хлороформом.

3 100 зой готовят иммуносорбенты на Фосфо,липидных антигенах других микробов, например хламидий.

Пример 2. Выделение антител к риккетсиям Провачека из лошадиной антисыворотки.

Сухой имиуносорбент суспендируют в физиологическом растворе рН /,0 и заполняют колонку (100 ммх25 мм).

Колонку с иммуносорбентом промывают физиологическим раствором рН -7,0 до нулевой экстинкции. На колонку наслаивают антисыворотку к риккетсиям Провачека и пропускают ее через слой иммуносорбента в течеЗатем к одному объему носителя - по" лиакриламидному гелю добавляют равный .оЬъем полученной смеси антигенплексиглас, тщательно перемешивают и высушивают в токе воздуха до исчезновения запаха растворителя. Иолу" ченный иммуносорбент используют для выделения препаратов к риккетсиям Музера, Пример 4. Получение иммуносорбента для выделения чистых антител к риккетсиям Сибирика °

S качестве исходного материала для получения фосфолипидного антигена применяют инфицированную рик-. кетсиями Сибирика штамм К-1 ткань селезенки и брюшины белых мышей, зараженных внутрибрюшинно. Перед заражением белым мышам весом 16 18 г (за 4-5 ч) внутримышечно вводят

ГиДрокортизОн по 2,5 мг на ОДну

5 100767 мышь. Накопление возбудителя конт". ролируют микроскопией мазков-отпе. чатков, окрашенных по РомановскомуГимза. В опыте используют материал с 3-4"x крестным накоплением возбудителя. Извлечение антигена осуществляют по методу 1.3.). Полученный антиген растворяют в хлороформе из расчета 1 мл на органы от одной белой мыши. Последующие этапы получе.HHR иммуносорЬента проводят, как ука . зано в примере 1.

Ю

Пример 5. Получение иммуносорбента для выделения чистых антител к возЬудителю знзоотического аборта овец.

Исходным материалом для извлечения фосфолипидного антигена служат желточные оболочки куриных эмЬрионов, зараженных возбудителем энзоотического аборта овец штамм

ЕАЕ. Титр возбудителя должен быть не менее 10 ЯД О(0,2 мл при зара6 жении в желточный мешок ). Выделение антигена и получение иммуносорбента проводят, как указано в примере 1.

Пример 6. Получение иммуносорбента для выделения чистых антител к возбудителю венерической лимфогранулемы. 39

Для получения фосфолипидного антигена используют желточные оболочки развивающихся куриных эмбрионов, . инфицированных возЬудителем венерической лимфогранулемы штамм ЛГВ. зю

Титр возЬудителя в исходной взвеси, должен составлять 10 ЛД5,(0,25 мл при введении в желточный мешок),. Да". льнейшая обработка материала и получение иммуносорбента осуществля- 40 ется, как указано в примере 1.

Пример 7 ° Получение иммуносорбента на основе сефарозы 4В. для выделения антител к R. рrowazekh:.

Из желточной культуры риккетсий 4s

Провацека готовят фосфолипидный антиген (методика примера 1).Полученный антиген растворяют в хлороформе, иэ расчета 1 мл на 1 желточный мешок..

Растворенный антиген смешивают с рав- ® ным обьемом 0,54 раствора мелкой стружки полиметилметакрилата в хлороформе. Приготовленную смесь соединяют с равным объемом сефарозы 4В (фи рма Pharmacia),предварительно., обезжиренной хлороформом. Полученную смесь тщательно перемешивают и высушивают в токе воздуха до полного ис"чезновения запаха растворителя.

Получение иммуносорбента. проводят при 18-22"С.

Пример 8. Получение иммуносорбента на основе сефарозы 4В для выделения антител к Ch . psittaci.

Из желточной культуры возбудителя орнитоза, тем же способом гота" вят фосфолипидный антиген. Полученный антиген растворяют в хлороформе иэ расчета 1 мл на 1 желточный мешок. Остальные операции проводят та ким же образом, как в примере 1.

Пример 9 . Получение иммуносорбента на основе крахмала растворимого (ГОСТ 1063-62, Реахим) для выделения антител к R. prowazåéö

Из желточной культуры риккетсий

Провачека готовят. фосфолипидный антиген (тем же способом). Полученный антиген растворяют в хлороформе из расчета 1 мл на 1 желточныйл мешок.

Растворенный антиген смешивают с равным объемом 0,54 раствора мелкой стружки полиметилметакрилата в хлороформе. Приготовленную смесь соединяют с равным обьемом крахмала растворимого, предварительно обезжиренного хлороформом ° Полученную смесь тщательно перемешивают и высушивают в токе воздуха до полного исчезновения запаха растворителя. 8се перечисленные операции проводят при

l8-22чС.

Пример 10. Получение иммуносорбента на основе крахмала растворимого (ГОСТ 1063-62. Реахим) для выделения антител к Ch. psittaci.

Все операции проводят аналогичным образом с той лишь разницей, что работают .с фосфолипидным.антигеном возбудителя орнитоза.

Для извлечения специфических антител соответствующий иммуносорбент суспендируют в физиологическом растворе рН 7,0 и заполняют колонку. Последующие этапы работы изложены ранее (пример 2).

В табл. 2 приведены результаты сравнительного применения иммуносорбентов., приготовленных на основе различных инертных носителей, для: выделения антител к риккетсиям

Провачека и хламидиям орнитоза.

1007676,Таблиц а 2 Инертный носитель (основа иммуносорбента) Удельная ак тивность исходной сыворотки,ГЕ/мг белка

Иммунная сыворотка

° » «Ю Р

Ф бФМФЮЬ ВФФЮ4Ь

Полиакриламид- ный гель

К риккетсиям

Провачека

32,1

820

25,5

К хламидиям орнитоза 1

Сефароэа 4В

516

16,8

30,$

К риккетсиям

Провачека

К хламидиям орнитоза

955 2

37,4

25 5

536,8

16,8

Крахмал растворимый

К риккетсиям

Провачека

753,1

25,5

29,5

К хламидиям орнитоза

24,5

16,8 412,0

Сравнительные данные по стабильно сти получаемых иммуносорбентов (но ситель - полиакриламидный гель) приведны в табл, 3.

Т а б л и ц а 3

Иммуносорбент

Кратно ть использования

12

13

Иммуносорбент для выделения антител к риккетсиям Nyзера

Известный способ

Предлагаемый -"9

Иммуносорбент для выделения антител к риккетсиям Сибирика

Известный способ

Предлагаемый - Р-. т

Иммуносорбент для выделения антител к возбудителю энэоотического аборта овец

Известный способ

Предлагаемый -"9

16

Таким образом все приготовленные .иммуносорбенты отличаются достаточно высокой специфической активностью.

Иммуносорбент для выделения антител к риккетсиям Провачека

Известный способ

Предлагаемый

Иммуносоовбент для выделения антител к возбудителю орнитоза

Известный способ

Предлагаемый

Удельная активность вы деленных ант тел, ГЕ/мг

|белка оэффициент очист". и (отношение удель" ой активности антиел к удельной активости исходной сыворотки) 9 1007676

В табл. 4 приведены результаты кетсиям и хламидиям орнитоза в сравмногократного применения иммуносор- нении с иммуносорбентами, полученныбентов для выделения антител к рик- ми известным способом, Табли ца4

Специфическая активность "чистых" антител

Иикл сорбции элюции к хламидиям орнитоза к риккетсиям Провачека

Предлагаемый

Известный

Предлагае- Известный . мый иммуно иммуносорсорбент бент иммуносорбент иммуносорбент

5632

5632, 5120

4608

4608

1158

1158 1440

210

«э

Специфическая активность полученных антител измеряли в ГЕ х мл (из- 4в мерение не проводилось).

Таким образом предлагаемые иммуносорбенты сохраняли специфическую активность несмотря на многократное использование. На протяжении длитель- ного срока наблюдения с их помощью удавалось получить достаточно высокий, практический однозначный ypd» вень специфических антител, Иммуносорбенты, полученные известным способом после 10-13 кратного примене" ния из-за недостаточной механической прочности и ухудшения колоночных свойств теряют специфическую активность.

Технико-окономическая эффективность заключается в возможности получения иммуносорбентов, обладающих высокой стабильностью и возможностью многократного использования .

Составитель О, Скородумова

Техред С.Мигунова Корректор м. щарфйи .,1 Т

« ° ° ° » ««» ««юМВ4

Редактор Е. Лушникова

Заказ 2177/6 Тираж 711 Подписное

ВНИИПИ Государственного..комитата. СССР по делам изобретений и открытий

113035, москва, К-35, Раушская наб., д. 4Я

<е е»

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул; Йроектная, 4

«« .1

3

5

7 .8

11

l2

13

17

52

5376

4803

5632

51 20

5376 .4608

5632

5376

5376

4608

5376

4864

4608

2688

2816

2816

2304

2638

2816

2304

256е

2304

2304

2304

2816

256Р

2304

2432

2304

2304

2816

2688

2304 .

1600 I 152

190