Способ получения иммуносорбента для выделения антител из кроличьей овальбуминовой сыворотки
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОРБЕНТА для ВЫДЕЛЕНИЯАНТИТЕЛ из КРОЛИЧЬЕЙ ОВАЛЬБУМИНОВОЙ СЫВОРОТКИ, путем химической модификации кремнеземного носителя с последующей сорбцией овальбумина, о т л и ч а ю -г щ и и с я тем, что, с целью повыиения сорбционной емкости И1«в«уносорбента по выделяемым антителам путем повьшения сорбционной емкости по антигену ,модицикацию носителя осуществляют обработкой его в токе инертного газа сначала парами треххлористого фосфора при 170-180С в течение 1-2 ч затем - стиролом при 200-210 0 в , течение 1-2 ч. (Л
11% (11) СОЮЗ СООЕТСНИХ
НМ
РЕСПУБЛИН (Я) A 61 К 47 00 й)СУДАРСТ8ЕННЫИ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТЬФ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
"" Ф 1 4ЖЮЛ "." " И64Ю 1 Май
К ABTOPCHOlVlY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3318244/28-13 (22) 09.07.81 (46) 07.04 83. Бюл. 9 13 (72) А, Н. Волкова, A.Á.Жебрун, Л.В. Иванова, Н.Б. Федотова, В.Ю. Трекало, В.И.Яковлев, Ф.С.Носков и А.И. Крашенюк (71) Ленинградский ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового
Красного Знамени технологический институт им. Ленсовета и Ленинградский орцена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера (53) 543.88(088 8) (56) 1. Kay G. Lilly И.D. Biochim, Biophys Acta, 198, 276, 1970, 2. Н.Н. Weetall "Preparation and
Characйег1гайion of. Autigen and
Antibody Adsorbents Covalently Coupled to an Inorganic Carrier", Biochem, J, 1970, 117, 257-261. (54) (57 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОРSEHTA ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ ИЗ КРОЛИЧЬЕЙ ОВАЛЬБУМИНОВОЙ СЫВОРОТКИ, путем химической модификации кремнеземного носителя с последующей сорбцией овальбумина, о т л н ч а ю — . шийся тем, что, с целью повыаения сорбционной емкости иммуносорбента по выделяемым антителам путем по выаения сорбционной емкости по антигену,модицикацию носителя осуществляют обработкой его в тске инертного газа сначала парами треххлористого фосфора при 170-180 С в течение 1-2 ч затем — стиролом при 200-210 С в течение 1-2 ч.
1009473
11
Р
ili0 0Н
При обработке фосфор (III) содержащего силикагеля парами стирола за счет активационного воздействия электроннодонорной фосфор (III) содержащей поверхности протекает предварительная сорбция мономера стирола, способствующая дальнейшей полимериэации. Конец полимеризации наступает в результате реакции карбониевого иона растущей цепи с отрицательно заряженной кремнекислородной группой, образовавшейся в процессе:.активации фосфорной группировки и полимеризации стирола:, 0 0
l 1 — CK -C-$l-0- г, 0 —"
ll о— — 1
+ l lh
Th 0 0 0 щр
Изобретение относится к области иммунохимии и может быть использовано для выделения чистых специфических антител методом аффинной хроматографии.
Известны способы получения иммуно- 5 сорбентов для выделения антител из кроличьей овальбуминовой сыворотки, заключающиеая в модификации органических и неорганических носителей с последующим закреплением антигена - 10 овальбумина.
Известны способы получения иммуносорбентов для выделения антител иэ кроличьей иммунной сыворотки на основе целлюлозы. Наиболее распростра-- f5 ненным методом получения таких иммуносорбентов является триазиновый метод, заключающийся в обработке целлюлозы или ее производных 2-амино-4,б-дихлор-симмтриазином, раствором карбоната натрия и соляной кислоты с последующей промывкой водно-ацетоновой смесью и 0,1 М фосфатным буфером и связыванием белка — антиг".на за счет реакции с аминогруппой белка (1j . >5
Недостатками этого способа являются сложность и длительность получения таких сорбентов, а также то, что иммуносорбенты .на целлюлозной основе не находят .широкого применения из-эа набухания и сжатия под давлением, кроме того, такие сорбенты подвергаются действию микроорганизмов. ,Наиболее перспективными являются неорганические нерастворимые носители, так как они не атакуются микроорганизмами, устойчивы к изменению рН, дешевы и долговечны.
Известен способ приготовления антиген- стеклянного иммуносорбента для выделения антител из кроличьей. 40 овальбуминовой сыворотки, заключающийся в химической модифИкации носителя — пористого стекла — 10%-ным раствором -аминопропилтриэтоксилана в метиловом спирте или толуоле, по- 45 следующем превращении алкиламиносилан — стекла в ариламинопроизводные с помощью реакции с и-нитробензоилхлоридом, восстановлении нитрогрупп
Na S2O3 и сорбцией атигена — овальбумина. Иммуносорбент проьывают и хранят при комнатной температуре f2) .
Количество белка, связанного с носи»" телем, составляет 14-18 мг/г. Коли-чество выделившихся антител увеличивается с повышением концентрации оваль- бумина на носителе и составляет
53,4-100%.
Недостатками этого способа получения иммуносорбента являются: низкая.сорбционная емкость полученных иммуносорбентов по выделяемым антителам вследствие низкой сорбционной емкости по овальбумину, а также нежелательная неспецифическая сорбция.
Целью изобретения является повышение сорбционной емкости иммуносорбента по выделяемым антителам эа счет повышения сорбционной емкости по антигену.
Цель достигается тем, что по способу получения иммуносорбента для выделения антител из кроличьей овальбуминовой сыворотки путем химической модификации кремнеземного носителя с последующей сорбцией овальбумина модификацию носителя осуществляют обработкой его в токе инертного газа сначала парами треххлористого фосфора:. при 170-180 С в течение 1-2 ч, затем—
О стиролом при 20,0-210 С в течение
1-2 ч.
В результате обработки образуется иммуносорбент, устойчивый в интервале рН 2,0-8,5 с размером пор 100 А, S 2. групп в поверхностном слое сорбента 1,5 мг/г. Эти углеродные группы представляют собой фенил-виниленовый фрагмент, непосредственно связанный с атомом кремния. Механизм реакций, протекающих в результате модификации силикагеля парами треххлористого фосфора в токе инертного газа (аргона или азота) и парами стирола в токе газа-носителя (аргон, азот), можно представить сле-, дующими схемами. В результате взаимодействия с PCZ> на поверхности силикагеля образуются следующие группы 1009473 При температуре обработки 200 210 С протекают процессы, сопровож0 дающиеся выделением паров воды и Jf О t 200-210 6 -.8-С-Е»- 6 -II-C«- г Н20 Ph Ph фенил-виниленовый фрагмент л Расчет количества элементарных фенилвиниленовых фрагментсв на поверхности синтезированного углеродсодержащего сорбента показал наличие на поверхности синтезированного сорбента 4-6 элементарных фенил-виниленовых фрагментов, образующих полифенил-. виниленовую структуру углеродного покрытия, связанного Si-С-связями 20 с силикагелями, на которую эффективно сорбируется антиген -ь - - с - -иPh РЬ Применение метода оптической спектроскопии в отраженном диффуэионно рассеянном свете показало наличие полос поглощения с максимумами при ЗО A -=- 430 нм и Я = 500-510 нм. Эти полосы соответствуют числам полифенилвиниленового ряда поверхностных сое- . динений, образовавшихся в результате реакций полимеризаций, конденсации и дегидрогениэации, протекающих на поверхности носителя. Оценка длины цепи сопряжения этих соединений показала,что,элементарный фрагмент нолифенил-виниленовой. цепи можно оценить .в 2,5 эффективных двойных свя- 40 зи.3ти образцы имеют коричневый цвет, что характерно для поливинил-фениленов. Количество химически сорбированного антигена — овальбумина составляет 36,0 мг/г, что позволяет 15 значительно повысить емкость иммуно.сорбента .rio антителам. Увеличение или уменьшение температуры обработки носителя стиролом до 180 или 250 С не приводит к изменению количества углерода в поверхностном слое, однако структура поверхностных групп в обоих случаях различная, при 180 С в поверхностном 0 слое образуется линейный полимер счирола, соединенный с поверхностным атомом кремния Si-Î-С-связью,а при о 250 С - конденсированный сетчатый полимер стирола. Количество химически сорбированного антигена на носите-60 лях,получейных при 180 и 250оС, снижается до 1,9 и 27 7 мг/г соответственно. Проведены опыТы по проверке специфичности полученных иммуносорбентов. Для этого использовали неспе- 65 газообразного водорода и образованием полнфенил-виниленовой структуры углеродного покрытия носителя цифичную к овальбумину бычью иммуносыворотку (BSA) и специфичную к овальбумину кроличью антиоваль буминовую иммуносыворотку. Биологическую активность. антител определяют по реакции непрямой гемаглютинации (РНГА) с использованием микротитратора системы Такачи. . На иммуносорбентах, полученных в результате обработки носителя стиролом при 200-210С C т.е. содержащих в поверхностном слое полифенил-виниленовые структуры, наблюдается только .специфическая сорбция антител из кроличьей иммуносыворотки. Количество ;выделенных антител составляет 90%. ,Регенерацию сорбента проводят традиционным методом путем:диссоциации с помощью HCR при рН 3. Пример 1. Навеску силикагеля 5 г марки ШСК с размером пор 100 А .и удельной поверхностью 240 м2/г, высушенного при 180 С, помещают в реактор проточного типа и в токе инертного газа-носителя (азот) обрабатывают парами РСРу при 170 С в течение 1 ч, удаляют потоком дазаносителя (азот) избыток РСЕ> и образовавшийся HCZ, затем обрабатывают ° при 200 С парами стирола при конценто рации его 5 мг на 1 л газа-носителя (азот) в токе инертного газа в течение 1 ч, в реакторе проточного типа. Расход. инертного газа 15 мл/мин ° Далее проводят сорбцию овальбумина в . емкостях на 100 мл при 4оС. Концентрация овальбумйна 8 мг/мл. Отношение жидкой к твердой фазе, т.е. объема раствора овальбумина к навеске, 10:1 (50 мл). Время контакта навески с раствором 3 ч. Полученный иммуносорбент промывают фосфатным буфером рН 7,2 до отсутствия белка в смывах. Емкость сорбента по овальбумину 36,3 мг/г. Количество выделяемых антител 90%. Пример 2. То же, что в примере 1, но в качестве инертного газаносителя используется аргон. Расход инертного газа 20 мл/мин, Концентрация овальбумина 10 мг/мл ° Емкость сорбента по овальбумину 36,4 мг/г. Количество выделяемых антител 89,5%. 1009473 Составитель О. Скородумова Техред A.Âàáèíåö Корректор A. Ференц Редактор О. Юркова Заказ 2539/4 Тираж .711 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Пример 3. То же, что в при мере 1, но навеску силикагеля обрабатывают парами РСМД при 170 С в течение 2 ч. Емкость сорбента по овальбумину 36,3 мг/r. Количество выделяемых антител 88,0%. 5 Пример 4. То же, что в примере 1, но стиролом обрабатывают при 210 С. Емкость сорбента по овальбумину 36,2 мг/г. Количество выделяемых 0 антител 89% ° Пример 5. То же, что. в примере 1, но стиролом обрабатывают в течение 2 ч. Емкость сорбента по овальбумину 36,15 мг/г. Количество выделяемых антител 88%. Пример .6. То же, что в примере 1, но стиролом обрабатывают в течение 2 ч при 200 С. Емкость сорбента по овальбумину 36,1 мг/г. Количество выделяемых антител 88%. Таким образом, предлагаемый способ позволяет приготовить иммуносорбент на основе неорганического носителя - силикагеля, содержащий в поверхностном слое полифенил=. виниленовые структуры и антигеновальбумин в количестве 36,0 мг/г, что почти в 2,5 раза больше, чем в прототипе. Этот сорбент не требует затрат большого количества времени, является специфичным и биоселектив.ным к антителам кроличьей овальбуминовой сыворотки, химически устойчив, долговечен и дешев. Количество выделяемых антител примерно в 2 раза выше, чем в прототипе, и сорбент обладает всеми . достоинствами, присущими неорганическим сорбентам. а
