Способ определения степени гомологии последовательности нуклеотидов днк

 

СОЮЗ СОВЕТСИИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

PEGflVS JlHH

SU„„1 468

3ар С 12 N 1 00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТЪЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3332020/28-13 . (22). 29.07.81 (46) 23.04.83. Бюл. И 15 (72) Я.П. Швецов (71) Горьковский научно"исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (53) 616.07(088.8) (5Ü) 1. Nicleus Acids Research; N-J, 1978, Ч. 5, р. 2033-2037. (54).(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ

ГОЮЛОГИИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НУКЛЕОТИДОВ ДНК путем выделения и очистки препаратов ДНК из исследуемого мате- риала, постановки реакции гибридизации выделенной ДНК с радиактивно меченой низкомолекулярной реперной

ДНК, отделения гетеродуплексов от .несвязавшейся реперной ДНК .с последующим подсчетом радиоактивности образовавшихся гетеродуплексов, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью ускорения и повышения воспроизводи-: мости метода; для реакции гибридизации используют высокомолекулярные фрагменты исследуемой ДНК и низкомолекулярные реперйой ДНК, а разделеl ние гетеродуплексов от несвязавшейся реперной ДНК проводят с помощью электрофореза в геле при температуре, равной температуре гибридизации.

1013468

Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть применено для решения вопросов систематики различных организмов, t

Известен способ определения степени гомологии последовательности нуклеотидов ДНК путем выделения и очистки препаратов ДНК из исследуемого материала, постановки реакции гибри" дизации выделенной ДНК с радиоактивно меченой низкомолекулярной реперной ДНК, отделение гетеродуплексов от несвязавшейся реперной ДНК с последующим подсчетом радиоактивности образовавшихся гетеродуплексов t 1 }.

Однако известный способ трудоемок и длителен, анализ 5-6 видов

ДНК занимает около месяца и не удается разделить образовавшиеся в результате реакции гомо- и гетеродуплексы радиоактивных фрагментов, что затрудняет расчет степени гомологии нуклеотидных последовательностей.

Целью изобретения является ускорение и повышение воспроизводимости метода, 30

Цель достигается тем, что согласно способу определения степени гомологии последовательности нуклеотидов ДНК путем. выделения и очи тки препаратов ДНК из исследуемого материала, постановки реакции гибридизации выделенной ДНК с радиоактивФ но меченой низкомолекулярной репер35 ной ДНК, отделения гетеродуплексов от несвязавшейся реперной ДНК с последующим подсчетом радиоактивности образовавшихся гетеродуплексов, для реакции гибридизации используют высокомолекулярные фрагменты исследуемой ДНК и низкомолекулярные реперной ДНК, а разделение гетеродуплексов от несвязавшейся реперной

ДНК проводят с помощью электрофоре45 за в геле при температуре, равной температуре гибридизации, Способ осуществляют следующим образом, Реакцию ДНК-ДНК гибридизации проводят в растворе, в запаяных капиллярах или ампулах, в известных условиях или заданных экспериментатором. Но в реакцию берут ДНК с разной молекулярной массой, Исследуемые ДНК имеют большую молекулярную массу 1,более 1 млн. дальтон ), а фрагменты меченой радиоактивной реперной ДНК дробят ультразвуком до величины 100000-200000 дальтон.

Поэтому образующиеся в результате реакции гибридизации гетеродуплекСы ,исследуемых ДНК и меченых радиоак- тивных реперных фрагментов будут иметь большую молекулярную массу, чем несвязавшиеся с исследуемой ДНК меченые радиоактивные фрагменты. ,Продукты реакции гибридизации наносят в лунки на пластину агарозного геля и разгоняют в приборе для вер" тикального электрофореза в режиме, при котором гель не нагревается вы-. ше 60ОС, т.е. выше температуры инкубации. Это предотвращает плавление образовавшихся гетеродуплексов.

В качестве свидетеля при электрофорезе примейяют бромфеноловый синий, электрофоретическая подвижность ко" торого в данных условиях примерно одинакова с подвижностью несвязавшихся меченых фрагментов ДНК. После электрофореза пластину геля окрашивают 13-ным раствором бромистого этидия, анализируют в ультрафиоле-. товом свете и разрезают по пробам.

Высокомолекулярные молекулы исследуемых ДНК и гетеродуплексы их с ме чеными фрагментами ДНК будут находиться в верхней части геля, а не- . связавшиеся меченые фрагменты ДНКв нижней части.

Нижнюю часть геля с несвяэавшимися мечеными фрагментами ДНК удаляют, а верхнюю часть геля разрезают по пробам, Пробы просчитывают на радиоактивность. Из каждого значения радиоактивности по пробам . высчитывается значение, полученное при просчете контрольный пробы, где в реак" цию гибридизации не бралась высокомолекулярная ДНК, а были только од" ни низкомолекулярные меченые фрагменты реперной ДНК. В пробе, где проводилась гибридизация высокомолекулярной реперной ДНК и низкомолекулярных меченых фрагментов реперной ДНК, значение радиоактивности будет самым большим. Это значение и степень гомологии принимают эа 1003 и относительно ее расчитывают степень гомологии других исследуемых

ДНК.

Пример. Ставят 7 параллельных реакций 6 штаммов стрептококков.

В качестве реперного был выбран штамм Streptococcus facceum 7379.

Фрагменты ДНК этого штамма размером

\ товым светом. активность.

Иэ значений радиоактивности проб вычитают -значение радиоактивности контрольной пробы (Н 7), где в реак- . цию гибридизации были взяты только ч уэ ниэкомолекулярные фрагменты меченои реперной ДНК и не было добавлено высокомолекулярных исследуемых ДНК.

Значение радиоактивности пробы .

М 1 получают самым высоким, так как

ЗЕ в ней были гетеродуплексы, образовавшиеся в результате гибридизации высокомолекулярной ДНК реперного штамма и ниэкомолекулярных меченых фрагментов реперного штамма. Значение степени гомологии ДНК в пробе я 1 принимают за 1004 v относительно ее расчитывают степень гомопогии с

ДНК реперного штамма ДНК других исследуемых штаммов.

Предложенный спосо0 определения степени гомологии нуклеотидных после. довательностей ДНК и использованием

: для разделения гетеродуплексов, об3S

Ю

3 101 . 300-400 нуклеотидов были помечены тритием (Н ) и имели удельную радиоактивность 3000 имп/мкг.

Эта активность недостаточно высока, поэтому соотношение взятой в реакцию меченой и немеченой ДНК было 1:1 (при более высокой радиоактивности это соотношение можно увеличить до 1-.100 до 1:1000).

Реакция гибридизации проводилась в 1 И стандартном солевом растворе (0,15 И - NaC1; 0,015 И - цитрат»Иа, рН=7,0). Дпя этого в стеклянную микропробирку помещают 1 мкг исследуемой ДНК в объеме 20-25 мкл, в таком же количестве и объеме добавляют еченые фрагменты реперной ДНК. Иикропробирку герметически закрывают или запайвают и помещают на 510 мин в кипящую водяную баню для денатурации ДНК. Затем микропробирку с реакционной смесью помещают в термостат с температурой 60ОС для инкубации в течение 18-24 ч.

По истечении времени инкубации пробирку вскрывают к пробе добавляют

5 мкл 204-ного раствора сахароэы с 13-ным бромфеноловым синим. Пробы наносят s лунки на пластине 8-124

AAAf геля (полиаккриламидного геля) в приборе для вертикального электро- фореза. Гель можно формировать как на пластинах так и в трубках, а электрофореэ на пластинах можно npo" водить -как в приборе для вертикаль.,ного, так и в приборе для горизонтального электрофореэа. Электрофореэ проводят в течение 1-2 ч в трисборатном буфере рН 8,0 следующего состава: трис-НС1 - 0,09 И; НЭВО0,09 И; ЭДТА - 0,0025 И. Напряжение и силу. тока подбирают с таким расчетом, чтобы пластина не нагревалась до 60оС, для предотвращения плавления образовавшихся при реакции гибридизации гетеродуплексов.

Верхнюю камеру прибора подключают к отрицательному электроду, а нижнюю - к положительному, Так как молекулы ДНК имеют суммарный отрицательный заряд, они будут перемещаться вслед за фронтом свидетеля .к положительному электроду - в нижнюю часть геля. Бромфеноловый синий, выступающий в качестве свидетеля, 3468 ф имеет в данных условиях электрофоретическую подвижность„равную подвижности молекул ДНК размером 300400 нуклеотидов. Электрофорез прекращают при достижении свидетелем нижней границы геля. Гель окрашивают 1-: íûì раствором бромистого этидия в течение 10-20 мин и анализируют при освещении ультрафиолеНижнюю часть геля, содержащую отогнанные несвяэавшиеся с исследуемой ДНК фрагменты меченой реперной

ДНК, удаляют.

Верхнюю часть геля, содержащую образовавшиеся в результате реакции гибридизации гетеродуплексы исследуеwx и реперной ДНК, разрезают по пробам. Пробы просчитывают на радио разовавшихся в результате реакции гибридизации, и несвязавшихся радио активных фрагме .гов реперной ДНК эпектрофореза в 0,8-13-ном агарозном пластинчатом геле является менее трудоемким, легко воспрсузводимым, позволяет в 2-3 раза ускорить получение результатов по сравнению с известными. На исследование ДНК 6 штаммов стрептококков было затрачено 2 недели, по сравнению с известным 5-6 недель.

ВНИИПИ Заказ 2941/33 Тираж 521 Подписное

Ъ

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4