Способ подготовки питательной среды для выращивания фотобактерий @ @

 

СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ РАСРВАНИЯ ФОТОБАКТЕРИЙ Photobactёriшn leognathi,. предусматривающий приготовление исходной питательной среды,, содержащей истопники углеродаf азота, фосфора и минеральные соли, с последующимвыращиванием на ней фотобактерий, о т л и ч аю щ и и с я тем, что, с целью улучшения качества среды за счет накоплейия в ней ве1цеств, повывающих интенсивность свечения фотобактерий,исходную питательную среду смешивают в соотношении 2:3 с простерилизованной отработанной культуральной жидкостью, Полученной при выращивании фотобактерий на исходной питательной § в течение 2-3 ч и после начала воз (Л растания интенсивности свечения и последующем отделении бактериальных С «клеток.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ нееееее

ЙЖИУБЛИК (19) (11) 5(Я) С 12 N 1 20

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРОТУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3330479/28-13 (.22) 04.08.81 (46) 23.05е83.Бюле )) 19

ГОСУДАРСТНЕННЬЙ КОМИТЕТ СССР

re ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (72) А.Н.Шендеров Й.10,Попова и И.Ю.Виделец. (71) Крабноярскнй государственный университет и Институт биофизики им. Л .В.КИренского Сибирского, отде ления AH СССР (53) 579; 22 (088.8) . (56) 1 Hastings Х.N.tÈealson K.Í1

Bakterial Ь|о1Ипйаеесепве Апп меч.

Microbiology 1977, v.31 р.549-595..

2. Кузнецов АИ„Роййчева Э.K., Рожаева Л.П. Полусйнтетическая среда для светящихся бактерий рода

Photobacteriam. " Известия СО AH СССР (серия биологическая), Ham.1,1978, с.37-39. (54) (57) СПОСОБ ПОД1 ОКОВКИ ПИТА 1 ЕЛЬНОИ .СРЕДЫ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ФО 1 ОБАКТЕ РИИ Photohacterium leognathi,. предусматривающий приготовление исходной питательной среды, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли, с последующим выращиванием на ней фотобактерий, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью улучшения качества среды за счет накопления в ней веществ, повыаающих интенсивность свечения фотобактернй,исходную питательную среду смешивают в соотношении 2:3 с простерилизованной отработанной культуральной жидкостью, . полученной при выращивании фотобакrepas не иоиоднон питетеденои онеде Я в течение 2-3 ч и после начала возрастания интенсивности свечения и последующем отделении бактериальных клеток.- С: 1018971

Изобретение относится к микробиологии, в QaeTHocTH к способам культивирования светящихся бактерий, и может быть использовано при создании индикаторных систем.

Известен способ выращивания фото- 5 бактерий на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные .соли(1) .

Однако использование такой среды не обеспечивает высокой интенсивнос- 10 ти свечения, Наиболее близким к изобретению ,по технической сущности и достигаемому эффекту является способ подготовки питательной среды для выращивания фотобактерий Photobacterium<

leognath1,предусматривающий приготовление исходной. питательной среды, содержащей источники углерода,азота, Фосфора и минеральные соли, с последующим выращиванием на ней фотобактерий, .Согласно этому способу готовят питательную среду следующего сос" ,,тава,г:NaCl 30 = КНгРО 1= NgSQ 7 Н О 2>

0g2;Na@H:. Qp 12 Н О бу (ИН } НРПО.р5 цитрат Na 0,65; пептон 5; глицерин3 мл на 1 л дистиллированной воды 2 J

Недостатком известного способа является низкая максимальная удельная интенсивность свечения фотобактерий. (10 мкА) за счет низкого содержания в исходной питательной сре-..

2 ле аутоиндуктора синтеза люциферазы.

Целью изобретения является улуч- 35 шение качества среды за счет накопления в ней .веществ, повышающих ин» тенсивность свечения фотобактерий.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу подготов- (1 ки питательной среды для выращива- ., ния фотобактерий РЬоСоЬасСег1ша leognathi,,предусматривающему при;.отовление исходной питательной сре- ды содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли, с последующим. выращиванием на ней фотобактерий, исходную питательп ную среду смешивают в соотношении

2:3 с простерилизованной .отработанной культуральной жидкостью,полученю ной при выращивании фотобактерий на исходной питательной среде в течение .2-3 ч после начала возрастания интенсивности свечения и последующем отделении бактериальных клеток.

Сущность способа заключается в следующем.

На исходной иолусннтетической среде выращивают бактерии Photobacterium

1еоцпайМ штамМ 54 .Процесс культи- Щ вирования осуществляют с аэрацией при 28-30ОС. В фазе возрастания интенсивности свечения отделяютподработанную культуральную среду от бактерий, стерилизуют ее и добавляют к ней жид-gg кую полусинтетчческую среду из расчета: на 3 ч.подработанной среды 2 ч. полусинтетической. В полу енную комбинированную среду засевают свежую кулътуру фотобактерий и культивируют ее с аэрацией при 28-30 С.

На фиг. 1 показана, максимальная удельная интенсивность свечения на коМбинировайной среде (кривая 1), .равная 500 мкЛ. На фиг. 2 — динамика удельной интенсивности свечения в полусинтетической среде при стандартных условиях культивирования (известный способ}, Эасев в обе среды проводился из одной и той же клеточной суспензии, одновременно и в одинаковой дозе.

Пример 1. Готовят жидкую полусинтетическую среду следующего состава,.r:NaCl 30= КНдРО,11 МАЗО

7HgO 0,2; Ма ПРО ° 12Н О .О, б,р (ИН ) НРОу0,5,циграт Na 0,65,пептон 5, глицерин — 3 мл на 1 л дистиллированной воды. Для твердой среды добавляют eL1e агар-агар иэ расчета

22 г/л.

Бактерии, выращенные на твердой .полусинтетической среде, суспендируют в жидкой полусинтетической среде до получения однородной исходной суспензии. В колбы объемом 250 мл, со-держащие по 50 мл жидкой полусинтети еской среды, засевают по 1 мл исходной суспенэии. Культивирование ведут " на качалке при 28-30 С. Плотность бактерий измеряют фотоколориметрически; на ФЭК-54. (синий фильтр). Свечение измеряют на установке для регистрации свечения. В фаЗе возрастания 1 интенсивности свечения (обычно через 2-3 ч от начала культивирования) бактериальные клетки. осаждают центрнфугированием прн 7000 об/мин в течение 20 мин. Подработанную культуральную среду стерилиэуют при 0,5 атм,и она может храниться для использования в комбинированной среде. Комбиннрованн ло среду готовят из расчета:3 ч подработанной среды и 2 ч жицкой полусинтетической среды.

Вторичное .культивирование ведут в колбах объемом 250 мл, содержащих 50 мл комбинированной среды (30 мл подработанной + 20 мл .обычной полусинтетической) ..Исходную засевную суспензию готовят обычным способом, т.е. бактерии, выращенные на твердой полусинтетической среде,- суспендируют в жидкой полусинтетической среде до получения однородной суспензии.

По 3. мл этой суспензии засевают в колбы с комбинированной средой, культивирование ведут на качалке прн

28-30 С с аэрацией. Через 8-10 ч после начала культивирования удельная инМэнсивность свечения достигает максимума.

1018973

Пример . 2.Готовят. жидкую йолусинтетическую среду следующего сос-. тава,г: NaC1 ЗО„КН Р041у ЩБ047 Н О

0,2; Na НРО 12 НЯО 6; (NH+)

Бактерии, выращенные на твердой полусинтетической среде,. суспендируют в жидкой полусинтетйческой среде до 10 получения однородной исходной суснензии. В шесть колб. объемом 250 мл, содержащих по 50.мл жидкости полусин-., тетической среды, одновременно залива,:ют по 1 мп исходной суспензии.Культи- х (5

: вирование осуществляют н.а качалке при

28-30 С. Плотность бактерий измеряют фотоколориметрически на ФЭК-54. Сзе- „ чение измеряют на установке для регистрации свечения.Бактериальные клет ки осаждают центрифугнрованием при 7000 8О об/мин и течение 20 мии иэ.первой кол.бы через 2 ч после начала культивирования (до начала возрастания свечения), 25 из второй — через час после возрастания свечения, ие третьей — через"2 ч, из четвертой — через 3 ч, из пя той — через 4 ч, из шестой — через ..6 ч.Подработанную культуральную среду стерилизуют при 0,5 атм (.в таком виде она может храниться .для иенользо-- Зо ваиня B комбинированной среде). Комбинированную среду т отовят иэ расче- : тае 3 ч подработанной среды .и 2 ч жидкой полускнтетической среды.Вторичное культивирование ведут в кол 35

1 4 6 8 10 Время(ЧЮ бах объемом 250 мл, содерж "нх

50 мл комбинированной средЫ (30 мп подработанной. и 20 мп обычной полуо синтетической среды). -Ис..одную засевную. суспенэию готовят обычным способом, т.е. бактерии, вйращенные на твердой полусинтетической среде,:

-суспендируют в жидкой полусинтетичес. кой среде до получения. однородной суспензии. Ilo 1 мп этой суспензии засввают в 6 колб с комбинированиыьяюсредами.

Б седьмой кодбе была обьЯная полусйн тетическая среда (контрольная кслба) .

Культивирование ведут аа качалке при

28-30 С с аэрацией.

На фиг. 2 показана динамика.изменения интенсивности свечения у фотобаи» терий, растущих во Icex семи колбах. ..Кривые 1 — 6 соответствуют:изменению интенсивности свечения при .росте батстерий в.кОмбинирозаннщх средах,содержащих подработаиные среды, взятыв

as колб 1, — 6 соответств Юо BpR первичном культивировании-.. Кривая 7 соответствует изменению евечения лри росте бактерий в обычной полусинтетической среде. Отбор. среды через 2-3 ч после начала возрастания свечения является оптимальным варйаитом при создании комбинированной cpåäè для .получения максимальной интеисивностй свечения при вторичном культивировании.

Предложенный способ по оравнейию с известным позволяет повысить максимальную интенсивность свечения в

50 раэ.

BHHHIlH Заказ 3636/20

ТиРаж 523 Подписное.Филиал ППП Патент г. Ужгород,. ул.Проектная,4