Аналоги люлиберина, проявляющие ингибирующее действие на ход процессов овуляции у животных

 

(lgj (И) СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

21) 3308213/23-04

22) 23.06.81 (46) 15.07.83. Бюл. Р 26 (721 С.В.Буров, В.Ф.Мартынов,С.В.Николаев, М.П.Смирнова, В.В.Корхов, В.П.Макушева.и.Г.Е.Лупанова (711 Ленинградский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. A.A.Æäàíîâà (53) 547.964.4.07 (088.8) (561 1. Sandow 3., Konig W. Studies

with. fragments ofa hig h1у active апа-! оде о f hvte ini s ing, Hormone Re leasing Hormone -.J Endar 1979,8, 175-82.

2. Was ak Т., Hump-hries

Fofkers К., Baders С.l. А new category of onvtation inhibitors linear

LH" ЯН analogues having more than

then residues.-Biochem. Biophys.

Res.Соттнтщп., 1979, 86,9 3, 84 3-48.

3. Hoersch G W. Rebstock И.С., Wittle Е.L., T1ппеу F.J., Nicoioides Е.0., Hutt М.Р., Hich Т.F., Vandenbå1t J M Edg ren R Е., Re, el J.R., Dermody W.Ñ., Humphrey R.R

Synthesis and bio ioqica1 acti vity

of peptide antagonists оЕ Lulibe"

rin (Luteinisiny Hormone Releasing

Hormone) "J.Hed. Chem 1 979, 22, Р 8 93)-43.

3(51) 07 103/52; А 61 К 37/02 (54 1 АНАЛОГИ ЛЮЛИБЕРИНА ПРОЯВЛЯЮ

ЩИЕ ИНГИБИРУКХЦЕЕ ДЕЙСТВИЕ HA ХОД, ПРОЦЕССОВ ОВУЛЯЦИИ У ЖИВОТНЫХ» (57) Аналоги люлиберина формулы

А-Pro — 5er — TIr — QAQa -Lev — Агс — Pro ИНЕ1 где A=H ZD — Phe, проявляющие ингибирующее действие на ход процессов овуляции у живот.ных.

1028663

Изобретение относится к новым Однако эти соединения обладают биологически активным соединениям- противоположным действием, в срав- аналогам люлиберина, проявляющим ненни с предлагаемыми соедиингибирующее действие на ход про- нениями, они способны индуцироцессов овуляции, которые могут найти вать овуляцию у крыс, блокированприменение в медицине. ную фенобарбиталом.

Известны аналоги рилизинг гормона j13 формулы Известные ингибиторы люлиберина

Р„ нр с высокой активностью содержат в ,своей структуре остатки неприродных н.-ser -тъ -335er (Bu )-ахеи А ; — Pro йнб 1 О аминокислот, например (2)

I р 0 Pu- Pro-0РЬе — ЭМр-Ser-туг-Втър-Lou-Ar — Pro — Ыю ЙН или (3 )

3 S

Однако все эти ингибиторы имеют сложную структуру.

Цель изобретения - расширение арсенала средств воздействия на живой организм.

Поставленная цель достигается предлагаемыми аналогами люлиберина формулы

A- Prî — S е — Тя;;.ЭАВс — (.Bu -A — Pro йнИ, 29 (Х), I где А - а, водороду

Z-Р— P1> е проявляющими ингибирующее действие на ход процессов овуляции у животных.

Предлагаемые аналоги люлиберина имеют укороченную цепь, более прос-. ты по структуре по сравнению с известными. 35

Предлагаемое соединение получают путем фрагментной конденсации азид ным методом, по схеме {3+2)+2 или

1+ (2+2) +2. Соединение (1 ) получают из соединения (la ) путем присоединения карбабе нзокси-Э-фенилаланина методом и-нитрофениловых эфиров. В ходе синтеза в качестве временной защитной группы на N-конце пептидной цепи используют карбсбензокси« защьту. Гуано-группу аргинина защи щают нитрованием, гидроксильные группы серина и тирозина не защищают.

Используемые в синтезе пептидные фрагменты получают методом и -нитрофениловых или пентахлорфениловых эфиров. При получении метилового эфира карбобензокси-серил-тирозина может быть использован также карбо.диимидаый метод с добавле.нием 1тгидроксибензотриазола, а в случае метилового эфира карбобензокси- -аланил-лейцина и этиламида карбобензокси-пролина- — метод смешанных ангидридов. Очистку конечных продуктов осуществляют, в случае соеди- О нения {1а) с помощью ионообменной хроматографии на Сефадексе CM-25

s градиенте раствора ацетата аммония с последующей гель-фильтрацией на

Сефадексе 8-15 в 0,2н. уксусной кис лоте. Соединение (1 б 1 чистят с помощью двукратной препаратив ной тонкослойной хроматографии на силикагеле в системах: трет-бутиловый спиртуксусная кислота - вода (4:1у1) и хлороформ — метанол (9:4), с последующей гель-фильтрацией .на Сефедаксе (.Н-20 в этаноле.

П р и и е р 1. Пролил-серил-тирозил-В-аланил-лейцил-аргинил-пролил-этиламид (Х).

Карбобензокси-пролил-этиламид. К раствору 9 r (0,036 моль) карбобензокси-пролина в абс ° тетрагидрофуране прибавляют 4 мл (0,036 моль) М-метилморфолина. ОхлаждаЮт до -30 С и прибавляют, 5 мл (0,036 моль) изобутилхлорформиата. Перемешивают 15 мин при -30 C и 10 мин при постепенном повышении температуры бани, затем . снова охлаждают до -30 С и добавляют порциями 4 мл (0,063 моль) этиламина.

Перемешивают 1 ч при -30 С и 1 ч при

-20 С, затем оставляют на ночь в холодильнике. Растворитель удаляют под вакуумом, остаток распределяют между этилацетатом и 1 н. Н 50,„, Органическую фазу промывают водой, высушивают над сульфатом натрия, растворитель упаривают ° Получают

9,8 r продукта в виде белого кристаллического порошка. Выход 98%

T.ïë. 99,5-101 С. Здесь и далее данные элементного .анализа синтезированных соединений соответству- ют вычисленным значением С, Н, N.

Карбобензокси-йитроаргинил-пролил-этиламид. а) 2 г (0,72 моль) этиламида карбобензокси-пролина обрабатывают раствором бромистого водорода в уксусной кислоте в течение 45 мин. Растворитель упаривают и остаток высушивают в эксикаторе над едким кали. б1 К раствору гидробромида этиламида пролина, полученного как описанного выше, в диметилформамиде прибавляют при перемешивании 3,1 г (0,52 ммоль) пентахлорфенилового эфира карбобензокси-нитроаргинина

1 мл (0,72 жюль . триэтиламина. Вы1028663

30 держивают 4 сут при комнатной тем пературе, затем реакционную смесь подкисляют до рН 7 и растворитель упаривают. Остаток растворяют в хлороформе и промывают 3 раза 5%-ным раствором йаНСО, водои и 3 раза 5

1 н. НС1. Органическую фазу промывают водой и высушивают над сульфатом натрия. Растворитель упаривают и остаток кристаллизуют в эфире. При необходимости продукт переосаждают 10 из смеси метанол - эфир. Получают

1,41 г продукта в виде белого кристаллического порошка. Выход 57%.

T. пл. 143-144 С.

Метиловый эфир карбобензокси-серил-тирозина.

2 г (0,86 ммоль) гидрохлорида метилового эфира тирозина обрабатывают насыщенным раствором аммиака в хлороформе в течение 10 мин при комнатной температуре. Осадок отфильтровывают и растворитель упаривают. Остаток высушивают в вакууме в течение 1 ч и растворяют в этилацетате с добавлением небольшого количества диметилформамида. К полученному раствору прибавляют 4,2 r (0,86 ммоль) пентахлорфенилового эфира карбобензокси-серина и рН реакционной смеси доводят до 8 добавлением N-метилморфолина.Через

3 сут при комнатной температуре реакционную смесь подкисляют и растворитель упаривают. Остаток разбавляют водой и экстрагируют 3 раза этилацетатом. Органическую фазу про- 35 мывают, как указано в предыдущей методике, и растворитель упаривают.

Получают 3,6 г белого кристаллического порошка. Выход 100%..Т.пл. 103 о

105 С. 40

Иетиловый эфир карбобензокси-пролил-серил-тирозина. а) 1 г (0,24 ммоль) метилового эфира карбобенэокси-серил-тироэина растворяют в трифторуксусной кислоте

45 и пропускают ток бромистого водорода в течение 30 мин. Продукт осаждают абсолютным эфиром, отфильтровывают, многократно промывают абсолютным эфиром и высушивают в эксикаторе над едким кали.

6) Гидробромид метилового эфира серии-тироэина, полученный как указано выше,растворяэт вдиметилформамиде и к полученному раствору прибавляют при перемешивании 0,89 r (0,24 ммоль) и-нитрофенилового эфира карбобензокси-пролина и 0,26 мл (0,24 ммоль)

М-метилморфолина. Через 2 сут при комнатной температуре растворитель 60 упаривают и остаток растворяют в этилацетате. Полученный раствор обрабатывают, как в случае карбобензок1си-нитроаргинил-пропил-этиламида..

Получают 0,87 г белого кристалличес- 65 кого вещества. Выход 70%. Т.пл. 176

178 С.(«.} — 37 (с 1, метанол).

Гидразид карбобензокси-пролилсерил-тирозина.

1,14 г .(0,22 ммоль) метилового эфира карбобензокси-пролил-сернлтирозина растворяют в кипящем метаноле и к полученному раствору прибавляют 0,86 мл (2,7 ммоль) гидразина. Реакционную смесь выдерживают в холодильнике в течение 1 сут. Продукт довысаживают эфиром, отфильтровывают и промывают смесью метанол эфир. Перекристаллизовывают из метанола. Получают 0,91 r светло-серого кристаллического порошка. Выход

80%. T пл. 204-205 C,(eL)2 -57,.5 (с 0,5 диметилформамид}.

Метиловый эфир карбобензокси-0-аланил-лейцина.

3 г (1,7 ммоль) гидрохлорида метилового эфира лейцина обрабатывают насыщенным раствором аммиака в хлороформе, как при получении метиловогс эфира карбобензокси-серил-тирозина, растворяют в этилацетате и к полученному раствору прибавляют, при перемешивании, 4,73 r (1,4 ммоль) и-нитрофенилового эфира карбобензокси-D-аланина и 0,95 г (1,4 ммоль).

1,2,4-триаэола. Перемешивают в течение 1 сут при комнатной температуре, затем реакционную смесь промывают

5Ъ-ным раствором NaHCO,водой 1н.

НС1,водой высушивают над сульфатом натрия, растворитель упаривают. Получают 4,82 г. продукта в виде масла.

Выход 100Ъ.

Метиловый эфир карбобензокси-пролил-серил-тирозил-)З-аланил-лейцина.

2,58 г (0,5 ммоль} гицразина карбобензокси-пролил-серил-тирозина растворяют в диметилформамиде и к полученному раствору прибавляют .

2,9 мл (1,5 ммоль) 5,2н. раствора

НС1 в тетрагидрофуране. Реакционную смесь охлаждают до -ЗООC и при перемешивании добавляют 0,622 г (0,6ммоль|. трет-бутилнитрита. Через 10 мин добавляют охлажденный раствор гидробромида метилового эфира Э-аланиллейцина, полученный из 3,52 r (1 ммоль } карбобензокси производного действием бромистого водорода в уксусной кислоте и 3,5 мп. (2, 5 ммоль) триэтиламина. рН реакционной смеси доводят до 8,5 добавлением триэтиламина. Раствор перемешивают 1 ч при — 30 С, 1 ч при — 10 С и 2 сут при комнатной температуре. Подкисляют 1н. НС1 и растворитель упарива ют. Остаток растворяют в этилацетате и обрабатывают как в случае метилового эфира карбобензокси-Р-аланиллейцина. Получают 2,7 г белого кристаллического порошка. Выход 77%.

T.пл. 137-140 C.iaLj 35О(c 0,5, метанол).

1028663

Гидразид карбобензокси-пролил-серил-тирозил-0-аланил-лейцина .

3,1 г (0,44 ммоль) метилового эфира пентапептида растворяют в кипящем метаноле и к полученному раствору прибавляют 1,72 мл (5,4 ммоль) 5 гидразина. Реакционную смесь выдерживают в холодильнике в течение 1 сут. Продукт довысаживают эфиром, отфильтровывают и промывают смесью метанол — эфир. Перекристаллизовы- !О вают из диоксана. Получают 1,63 r белого кристаллического порошка.

Выход 53%. T.ïë. 173-174 С.

Карбобензокси-пролил-серил-тирозил-О-аланил-лейцил-нитроаргинил-пРО-15 лип-зтиламид.

0,6 r (0.086 ммоль) гидразина пентапептида обрабатывают по методике, приведенной для метилового эфира карбобензокси-пролил-серил-тирозил-I)-ананил-лейцина. В качестве амино20 компоненты используют раствор гидробромида нитроаргинил-пролил-этиламида в диметилформамиде, полученного из 0,822 r (0,17 ммоль) карбобензокси производного действием бромистого водорода в уксусной кислоте. Реакционную смесь перемешивают 1 ч при

-30 С, 1 ч при-150С 2 сут при 4 С и 2 сут при комнатной температуре.

Реакционную смесь подкисляют и растворитель упаривают. Остаток растворяют в хлороформе, промывают водой и 3. раза 5Ъ-йым раствором бикарбо.ната натрия, затем снова водой. Выпадающий гель растворяют в метаноле 35 и объединяют с органической фазой.

Растворитель упаривают, остаток переосаждают из смеси метанол — вода. Маточный раствор упаривают и остаток хроматографируют на силика- 4(! геле в градиенте гексан-хлороформ

10о-ный раствор метанола в хлороформе. Получают 0,592 г продукта в виде белого аморфного порошка.

Выход 68%.

Пролил-серил-тирозил-D-аланил-лейцил-аргинил-пролил-этиламид.

0,2 r (0,02 ммоль ) этиламида защищенного гептапептида растворяют в метаноле с добавлением 10%-ной уксусной кислоты и подвергают каталитическому гидрированию в присутствии палладия на угле в качестве катализатора. Ход реакции контролируют с помощью электрофореза. Катализатор отфильтровывают и промывают55

10%-ной уксусной кислотой. Из Раствора упаривают метанол и остаток лиофилизуют. Лиофилизат растворяют в

0,005 М ацетате аммония и подвергают ионообменной хроматографии на ко- 60 лонке с Сефадексом СМ-25 (9 300 мм) в градиенте от 0,005 M до 0,5 N ацетата аммония. фракции, дающие положительную реакцию с реактивом Сакагучи, изатином и реактивом на тиро-. зин, отбирают, лиофилизуют и орессоливают на колонке с сефадексом g-15 в 0,2 н. уксусной кислоте (22 1050 мм)

Продукт лиофилизуют. Данные аминокислотного анализа: пролил 2,.L4 серин 1,10, аланин 1,00, лейцин

0,85, тирозин 0,91, аргинин 1,00.

Пример 2. Карбобензокси-Э -фенилаланил-пролил-серил-тироз ил-D-аланил-лейцил-аргинил-пролил-зтиламид (1 5). Гидразид карбобензокси-серил-тирозина.

2 24 r (0,54 ммоль) метилового эфира карбобензокси-серил-тирозина, полученного по методике, приведенной в примере 1, растворяют в кипящем метаноле и к полученному раствору прибавляют 2,1 мл (6,59 ммоль) гидразина. Реакционную смесь выдерживают в холодильнике в течение 1 сут. Продукт довысаживают эфиром, отфильтровывают и промывают смесью метанол — эфир. Перекристаллизовывают из водного метанола. Получают

1,4 r продукта в виде белого кристаллического порошка. Выход 63%.

T.пл. 190-192 С.

Иетиловый эфир карбобензокси-серил-тирозил-Т)-аланил-лейцина.

Гидробромид метилового эфира D—

-аланил-лейцина, полученный из 2, 36 г (0,67 ммоль) карбобензокси производного действием бромистого водорода в уксусной кислоте, растворяют в диметилформамиде. К раствору 1,4 r (0,34 ммоль) гидразида карбобензокси-серил-тирозина в диметилформамиде прибавляют при охлаждении 3,8 мл (1,02 ммоль) 2,65 н. раствора НС! в тетрагидробуране. Реакционную смесь охлаждают до -30 С и при перемешивании добавляют 0,42 г (0.4 ммоль) тРет-бутилнитрата. Через 10 мин

1 добавляют охлажденный раствор аминокомпоненты и 2,4 мл (1,7 ммоль) тРиэтиламина . рН реакционной смеси доводят до 8,5 добавлением триэтил- амина. Раствор перемешивают 1 ч при

-30 С, 1 ч при — 10 С и двое суток при комнатной температуре. Подкисляют 1 н. HC 1 и растворитель упа ривают, Остаток растворяют в этилацетате и промывают водой, 5%-ным раствором бикарбоната. натрия, водой, 1 н. НС!, водой. Высушивают над суль-, фатом натрия и растворитель упаривают. Остаток кристаллизуют из эфира, отфильтровывают и промывают на фильтре эфиром. Получают 1,48 r белого кристаллического порошка. Выход 73%. T.пл. 178-179оС (Ы) 2o — 30,5 (с 1, метанол)

Метиловый эфир карбобензокси-пролил-серил-тирозил-33-аланил-лейцина.

Синтез проводят исходя из 3,28 г (0,55 ммоль) метилового эфира тетрапептида по методике, аналогичной методике получения метилового эфира

1028663

7 карбобензокси-пролил-серил-тирозина,с добавлением 1,45 r (0,55 ммоль) пентахлорфенола. Получают 3,11 г продукта в виде белого кристаллического

- порошка. Выход 82%. Константы полученного соединения приведены в при мере 1.

Карбобензокси-О-фенилаланил-пролил-серил-тирозил-)Э-аланил-лейцил— аргинил-пролил-этиламид.

Этиламид пролил-серил-тирозил-D-аланил-лейцил-арганил-пролина, полученный по методике примера 1 (за исключением очистки с помощью ионообменной и гель-хроматографии } из

0,2 г (0,02 ммоль) защищенного производного, растворяют в диметилформамиде. К полученному раствору прибавляют 1 экв. 0.,1 н. НС l и О,033 r (0,02 ммоль) и -нитрофенилового эфира карбобензокси-) )-феиилаланина.

Ход реакции контролируют с помощью электрофореза. Реакционную смесь подкисляют и растворитель упаривают;

Продукт кристаллизуют в эфире, огфильтровывают, промывают этилацетатом и подвергают очистке с помощью препаративной тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе трет-бутиловый спирт - уксусная кислота — вода (4 1:1). Вещества, дающие положительную реакцию на тирозин и отрицательную реакцию с изатином, элюируют метанолом и 10%-ной уксусной кислотой, упаривают растворитель и продукт подвергают повторной очистке в системе хлороформ — метанол (9:4 ). Соединения, дающие положительную реакцию на тирозин и с реактивом Сакагучи, элюируют, как указано и очищают с помощью гель-фильтрации на колонке с Сефадексои LH-20 в этаноле (40 . 720 мм). Фракции, дающие указанные качественные реакции объединяют, разбавляют 10Ъ-ной уксусной кислотой и, после упаривания метанола лиофилизуют. Данные аминокислотного анализа: аргинин 0,79, серин 1,03, пролин 2,14, алании

0,96, лейцин 1,00,тирозин 1,02, фенилаланин 1,01 °

Чистоту синтезированных соединений контролируют хроматографически, не менее чем в трех системах, а в случае свободных пептидов также и электрофоретически ° Промежуточные соединения охарактеризованы;элементным, а конечные продукты — аминокислотным анализами..Значения оптического вращения приведены для неописанных в литературе соединений.

Проведены испытания биологической активности предлагаемых аналогов люлиберина: их влияние на процесс овуляции.

Опыты были проведены на половозрелых крысах-самках массой 180

200 r и на половозрелых самках кроликов массой 3,0- 3,5 кг. Поставлено

62 эксперимента на 34 животных ° Все

5 исследуемые препара вводят внутрибрйшинно в дозе 1 мг/кг на стадии поздний проэструс. Через 24 ч из ампулы микрометодом в стадии экструс изйлекают проовулировавшие яйцеклет10 ки и исследуют микроскопически: регистрируют количество и проводят морфологическое изучение их. Об угнетении овуляции судят по уменьшению количества проовулировавших яйце15 клеток и изменению их морфологического состояния.

Контролем служат интактные животные.

Исследуемые препараты — предлагаемые аналоги люлиберина с укороченной аминокислотной последовательностью: препарат 9 1 (соединение 1.o): н pr o — 5g r — Тмг — Васю — (.ем — Атс — pro HHEt

25 препарат 9 2 (соединение 16):

2 Д РЪе — Pro — Ser Тм -ЭАЬл — (.åà — АЩ Р о Н%

На основании проведенных исследований показано, что у интактных животных, служащих контролем, всегда

30 удавалось отметить расширение ампулярного отдела яйцевода, из которого путем надреза его извлекают 10-12 яйцеклеток, окруженных рыхлым Cumu)us oophorus. 1"величество проовулиРовавших яйцеклеток в контроле в среднем составляло 11.,0 + 1,3, количество желтых тел 14,1 «+ 2,1.

В группе животных, получивших препарат )" 1, как правило, наблюдают отсутствие расширения ампулярной части яйцевода. При промывании яйцеводов удавалось вымыть различное количество яйцеклеток, находящихся на различных стадиях партеногенетического дробления. Угнетение овуляции

45 сопровождалось снижением количества вымытых яйцеклеток до 3 по сравнению с II в контроле (P 0,05), что характеризует угнетающее действие указанного препарата на овуляцию.

50 данные этой серии опытов подтверждены на другой группе животных кроликах-самках, получавших препарат

9 1 в дозе 1 мг/кг внутривенно через 3 ч после спаривания (за 20 ч

55 до овуляции ) ° Угнетение овуляции характеризуют снижением количества проовулировавших фолликулов до 5,3 по сравнению с 9,3 в контрольной группе (Р (0,05).

Полученные результаты исследования влияния препаратов, на ход процесса овуляции (на крысах ) приведены в таблице.

1028863

Влияние на овуляцию

Препарат

Дегенерация

Неизм.

Угнетение

Блокада

11Ф2

Контроль

Кломифен

4 мг/кг б7

3,3

Лъ 1

1 мг/кг

5,0

Л": 2

1 мг/кг.

Иэ таблицы видно, что активность соединений (1 а ) и (1 б) сопоставима с активностью лучших из известных ингибиторов овуляции из числа аналогов люлиберина, однако предлагаемые ! препараты отличаются от других аналогов этого типа отсутствием таких трудных для пептидного синтеза аминокислот как Trp, рС fu, а также меньшим числом аминокислотных остатков.

Составитель. В.Волкова

Редактор Т.Веселова Техред C.Мигунова Корректор Л.Бокшан

Заказ 4888/21 Тираж 418 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-ЗБ, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Количест во животных

Среднее число вы мытых яйцеклеток

Супер овуляция

Ъ ингибирования