Способ получения пептидов, содержащих сульфат тирозина

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. синд-ву (22) ЗаЯвлено 12.1 2,77 (21) 77700g8/04 (23) Приоритет - (32) 29.11.76 (31) 1VPC07C/196017 (ЗЗ) ГДР

Опубликовано 15. 04. 82 Бюллетень № 14

Дата опубликования описания 15. 04. 82

Союз Соввтски>т

Соцналистическии

Республик

„„920053 (89) 128973 ГДР (51) N. Кл.

С 07 С 163/52

А 61 К 37/02

1асударстеенный комитет

СССР (53) УД1 547.964;

4 07(088.8) ао делам изобретений и открытий

Иностранцы 1

Нидрих Хартмут, Хертель Бригитте, Бинерт Иихаель и Кейлерт Манфред фаей) Авторы изобретения (ГДР) Иностранное предприятие

"Академие дер Виссеншафтен дер"— (71) Заявитель.(rg») (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ.;: СОДЕР> (АЦИХ

СУЛЬФАТ ТИРОЗИНА

Изобретение относится к способу получения пептидов, содержащих 6"20 остатков аминокислоты, а в частности

° панкреоциминпептидов, для биологической активности которых остаток тирозина должен быть этерифицирован серной кислотой, и используемых в фармацевтике их солей. >желудочно-кишечный гормон холецистокинин/пакреоцимин (PZ), его С-конечный гепта- и окта-, >0 пептид и церулеин, декапептид подобной последовательности из кожи лягуш" ки Hyle caerulae обладают способно-. стью сокращать желчный пузырь, расслаблять желчный проток, стимулиро- 15 вать выбрасывание энзимов экзокринной поджелудочной железы и ускорять прохождение по кишечнику. Они могут быть использованы, например, в качестве вспомогательного средства при рентге- оп новских исследованиях и имеют также перспективу использования в терапии.

Они имеют следующие формулы: РЕ октапептид

3S(Tqr (R0 )-Net- И "TrI>-Net-$ -04еИН оа

Церулеин

PCA-Gl>z Asp-Tyr(SO )-Thr-Gly-Trp-MetЬ

-Asp-Phe-%1 Кроме того, гумангастрин II гормон, стимулирующий кислотную секрецию в желудке, а также аналог С-конечного церулеин-гептапептида, подавляющий эту кислотную секрецию, содержат остаток сульфата тирозина.

Известны получение и биологическая активность церулерна и производ" ного, в котором имеется ацетилирована гидроксильная группа, треонина.:

Введение остатка серной кислоты в последовательность декапептида осуществляют .с помощью комплекса пиридин-SO». Превращение на этой стадии, очевидно, не количественное: Затем удаляют ацетильную группу ттутем щелочного омыления. После необходимой очистки выход продукта составляет 40.е.

Известно получение С-конечного октапептида панкреоцимина и его фарма" цевтическое использование и. связь>ва53 4 чение действующих на желчный пузырь

Р7,-пептидов по. возможности с простой ст ру ктурой .

Поставленйая цель достигается тем, что этерифицированный серной кислотой

l1o тирозину К-защищенный пептид, содержащий 2-б остатков аминокислоты, используют в качестве промежуточного продукта.

Способ получения Х-Туг(50 ) -Ие1-G1y-Тгр- Iet-Лю-РЬеЖ . где; Х =

H Oó00С СН СН СО НО С Н СН CO

H00C-CH CH CO, и другие ацильные

z остатки заключается в том, что защищенный трипептидный эфир Y-Тут-ИеьG1y 0-ал кил суп ьфируют, алкилэфи рную группу отщеппяют омылением, защищенный сульфированный трипептид конденсируют с Ттр-i let-ЛБр-Р1ье!И, преимущественно методом смешанных ангидридов, и полученный после отщепления защитной группы гептапептид ацилируют. при добавлении слабой органической щелочи, преимущественно Иэтилморфолина.

При переработке продукта после сульфирования используют воднощелочной буферный раствор, преимущественЬ

Для выделения защитного трипептида используют смеси высших спир -.в с уксуснокислым эфиром, преимущественно н-бутанолэтилацетат, В качестве защитной группы используют третичный бутилоксикарбонил и ее отщепление от гептапептида осуществляют 75-85-ной трифторуксусной кислотой при добавлении в избытке метоксибензолмеркаптоэтанола при комнатной температуре.

Получаемые при кислотной обработке фракции десуфатированного пептида такой we аминокислотной последовательности отделяют после ацилирования аминогрупп.

Существует способ, используемый для синтеза высших тирозинсульфатпептидов на примере нескольких N-ацилированных С-конечных гептапептидов панкреоцимина (PZ) .

Целью изобретения является получение кратчайшим путем 13ос-Туг(Ю )—

-Met-Gly-Trp-i ЬС- Ьр-PI>el lI с высоким процентом выхода, избегая неэкономичную операцию очистки, исходя из промышленного продукта Trp-Miet Asp-P1>ei4lz, использование его в качестве 5 исходного продукта для получения следующих, в особенности 7-аципированных

PZ-пептидов и, исходя из этого, полу3 9200 ние защищенного дипептида с РЛ-дека" ?,,;. дон... содержащим сульфат -гирозина. Б ведсние остатка серной кислоты в тирозине в незащищен :.ый октапептид происходит посредством концентриро" ванной серной кислоты, причем вслед-. ствие образования большого количества побочных продуктов, выход после. очистки 203 до — 254, Таким же способом получают ряд аналогов PZ-окта- >0 пептида, из которых те, в которых

М-конечная аспарагиновая кислота заменена другими аминокислотными остатками, малеиновой и фурмаровой кислотами, являются также биологически 15 высокоактивными.

Получаемые при использовании концентрированной с"-.ðíîë кислоты сульфонированные по ароматическому кольцу тирозина в положении 3РЕ-окта-, дека- 20 и додекапептиды, показывают высокую биологическую активность.

Другие побочные продукты при получении С-конечных последовательностей

РЛ являются исходными продуктами, 25 т.е. идентичный несульфатированный ряд, который может быть поручен также отщеплением Н ЯОь при переработке вследст вие кратковременной кислой реакции, производные с замещением у зО коп ьца триптофана, которые могут об-. разоваться во время ступенчатого синтеза при повторяющихся отщеплениях защитных групп-Вос посредством три. фторуксусной кислоты. Полученный в процессе синтеза простейший PZ-пептид высокой биологической активности является Нос-Тут(ЯО ) - Iet.-Gly3

-Trp-МеС-Asp-Р1 е141,. Остаток серной кислоты вводят в Вос-гептапептид на = последней стадии . Для больши нств а активных пептидных веществ удаление

К-конечной аминогруппы усиливает биологическую активность,и что введение

К-конечных ацильных групп, кроме того, из-за препятствия расщеплению посредством аминопептидаз, является выгодным для биологической активности.

Х-Tyr(OSO>)-Met-Ыу-Trp Met Asp-PheNH где".Х=НООС-СН СН СО, Н С СН ОСО-СИ;

-СН -СΠ—, Y-HO-CBHh-CH?C0.

В предлагаемом способе защищенный пептидный фрагмент, который может

5 920 состоять из 2-6 остагков аминокислоты и содержать остаток тирозина, этерифицируется посредством воздействия избытка комплекса пиридин-SOg или смесь из пиридина, хлорсерной кислоты s в диметилформамид/хлороформе и серной кислоты. При сульфатировании

Âîe-Tyr-Met-Gly OAt 30-кратным избытком Cl-SO H в смеси достигается 100i превращения. Расщепление связи эфирсерная кислота из-за кратковременной кислой реакции при обработке реакционной смеси предотвращается помещением в щелочную буферную систему, например NHg/N11„Cl. Продукт реакции 15 может быть легко извлечен из буферной смеси смесью высших спиртов, например .п-бутанолом или эфиром уксусной кислоты с выходом 703.

Преимущество способа заключается 20 в том, что могут быть использованы также и загрязненные продуктами Оацилтирозина производные защищенного тирозина, например N0-Di-Вас-Tyr, очистка которых обходится очень до- 2Б рого. При обработке выделением полученный О-ацилтирозиновый пептид количественно удаляется из тирозинсульфатного пептида. Вас-Tyr(SO ) - let-Gly-0At посредством щелочйого омы- зв пения переводится известным образом в трипептидную кислоту и выделяется посредством н-бутанол/уксусного эфира (выход 75 }

N-защищенная пептидная кислота, содержащая сульфат тирозина, может быть обычным методом сконденсирована в пептид со свободной > -аминогруппой. Для связывания Вас-Tyr(SO ) - LtGly с Ттр-Met-Asp-Рйе%1 используется щ преимущественно синтез смешанных ангидридов (883 выхода). Получение

Вос-защищенного С-конечного панкреоцимингептапептида Вас-Tyr(SO ) -Me Gly-Тгр-Met. Акр-Р} е%1 „и рои сходит таким способом с более высоким общим выходом и более высокой частотой, чем известными способами синтеза, в которых сульфатирование предпринимается как последняя стадия реакции.

3а счет предложенного способа обеспечивается полное расщепление азотно-, защитнай группы при одновременном минимальном кислотном гидролизе связи эфир-серная кислота, т.е. при минимальном отщеплении остатка SO от гидрокислотной группы тирозина, а также при одновременном минимальном

053 6 образовании побочных продуктов посредствам циклического защемления у остатка триптофана.

8 качестве благоприятного условия для отщепления бутилоксикарбонильной защитной группы установлено использование 75-853-ной трифторуксусной кислоты в присутствии избытка меркаптаэтанола и метоксибензола, При этом полностью исключаются побочные реакции на триптофане. Гидролиз эфира серной кислоты остается ниже 204. Очень выгодным является использование бутилоксикарбонильной защитной группы по сравнению с известными защитными груп" пами, которые могут отщепляться в слабокислой, нейтральной или щелочной средах.

Получаемый идентичный в последовательности пептид со свободной гидроксильной группой на тиразоле очень легко отделяется последующим азотным ацилираванием, если это необходимо для предусмотренной цели использования. Ацилирование полученного таким способом С-конечного панкреоцимингептапептида Tyr(OSO>) -Ме -Gly-Trp-1"1åt Asp-PheM1 осуществляют реакцией с активированными эфирами соответствующих карбоновых кислот, например с эфиром 2,4,5-трихлорфенил-и-гидроксифенил-уксусной и этиловым эфиром янтарной кислот или с ангидридом янтарной кислоты. Для этого гепапептид освобождают от трифторацетата слабым органическим основанием, преимущественно N-этилморфолином (И@1) . Ацилирование проводят при добавлении ХХЧ, Ион Na» при пере1рабатке остается на сульфированных гептапептидах. Из полученных таким образом ацил-PZ-гептапептидов сукцинил-РЕ-гептапептид, обозначаемый еще как дезамино-PZ-актапептид,(Х =

НООС-СН,СН -C0) показывает высокую активность при воздействии на желчный пузырь, которая почти равносильна активности церулеина. Производные и-гидроксифенилацетила и этоксисукцинила достигают толька 13 активнасУ ти церулеина.

Отделение "десульфатированных" побочных продуктов, мажет. осуществ. ляться противоточным разделением посредством хроматографии на декстрановом геле. Так как молекулярные ee" са обоих соединений различаются нез"1.

7 9200 начительно, эффект разделения пора- 1 зителен.

П р и и е р 1. Йммонийная соль

N третбутилоксикарбянол-Q-ñóëüôàòтирозил-L-ìeòèàíèë-глицин-этилового 5 эфира °

2 8 г (0,036 моль) пириди. а в

10 мл хлороформа охлаждают дс -10 С.

При перемешивании 30-40 мин в этот раствор добавляют по каплям 2,4 мл (0,037 моль) хлорсерной кислоты, причем следует поддерживать температуру

+1О С. По окончании добавления реакционную массу перемешивают еще 30 мин при 0-10 С, и добавлением затем о

10 мл дилатилформамида смесь комлекса пиридин-SO и пиридингидрохлорида переводят в раствор. 0,600 r (1,21 моль) Вос Tyx -Met-Gly OAt растворяют в 10 мл диметилформамида 20 и 10 мл пиридина и при перемешивании добазляют к раствору комплекса пиридин-S0> . Затем 5 ч смесь перемешио вают, грея на водяной бане при +35 С, растворитель удаляют в вакууме с 25 помощью масляного насоса при +45 С, и маслянистый остаток при (-5) -0 C при сильном перемешивании очень быстро смешивают с 200 мл 0, 1 N-Nh,,01/

/0,1N-М1 буферного раствора (рН 10,5) зо

Затем значение рН этим буферным раствором быстро устанавливают на 7,0.

Выпавшее в осадок из водной фазы твердое вещество переводят в раствор добавлением 70 мл смеси н-бутанол/

/уксусный эфир (2:1). Водную фазу отделяют, насыщают NaCl и трехкратно экстрагируют 70 мл указанной смеси. Органические экстракты объединяют, промывают насыщенным раствором NaC1 до тех пор, пока не исчезнут ионы ЯО,, и органическую фазу сушат над NHg SO(Раствор упаривают на половину. Раствор, содержащий и-бутанол для отделения Вос-ТугИос) — <>

-ИеС-Gly-OAt медленно при перемешивании вливают в 2,5-кратное количество холодного эфира, Выпавший в осадок продукт отсасывают, гщатель. но промывают эфиром и петролейным эфиром и сушат в вакууме над Р .a.

Выход;0,50 r (703). T.пл. 139-141 С

1 " „=- (-9,8) (С.=-1,0 a g e Twiформамиде) *Аминокислотный анализ после щелочного гидролиза: 1уг50ч

0,87; Tyr 0,05; let 0,89; Gly 1,0.

Чистоту продукта проверяют гонкослойной хроматографией на силуфоловых пластинках фирмы !(авалер" ЧССР в

53 8 системе (А) -ВыОп (ледяная уксусная кислота/вода (4: 1: 1) и (В) пиридин/

/н-:бутанол/ледяная уксусная кислота/ вода (20:30;б:24). P = O,бб;

u<,= 0,64, Пример 2 . Натриевая соль

1-третбутилоксикарбойил-О-сульфат-1,-тирозил-L-метионил-глицин.

0,500 г (0,84 роль) Вос-Tyr(SO NH ) - let-Gly-(Mt растворяют в <

5 мл смеси вода — этанол в соотношении 1:1 и при комнатной температуре, 45 мин перемешивают с 3 мл

1 н. ИаОН. Раствор упаривают в роо тационном i"eпарителе при +40 С до половины его обье«а и затем разбавляют 5 мл воды. Устанавливают

1 н. НС1 при +5 С рН раствора 3,0.

Водную фазу экстрагируют 50 мл смеси н-бутанол/уксусный эфир (2:l), затем насыщают Ха01 и тщательно взбалтывают с двумя порциями указанной смеси растворителя до 50 мл каждая. Органические фазы объединяют, промывают насыщенным раствором МаС1 и сушат над NazSO«

Растворитель удаляют в вакууме при +40 С, остаток сушат многократным выпариванием при добавлении хлороформа. Стекловидный остаток растирают со смесью эфир — петролейный эфир, твердое вещество тщательно промывают эфиром и петралейным эфиром и высушивают в вакууме над Р„ О,. Выход:

0,360 г (753); T.пл. 196-198 С.

Е -30 -= 6,8 (С-0,5 в диметилформамиде)

= О,б4; P = 0,57.

Пример 3. Натриевая соль

N-третбутилоксикарбонил-О-сульфат-L-тирозил-1-метионил-глицин-f„-триптофил-L-метионил-L-аспартил-L-фенилаланинамида.

0,360 г (0,631 моль) Вос-Тут(>0 3 Na) -Ией.-Gly-OH растворяют в 20 мл диметилформамида, добавляют

0,079 мл (0,631,моль) N-этилфорфолина и реакционный раствор охлаждают до -25 С. Добавляют к нему 0,086 мл (0,631 моль) изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты и затем выдерживают для активирования 10 мин при

-25 С. 0,400 г (0,631 моль) Trp- let-Asp-PheN11 растворяют отдельно

2. в 20 мл диметилформамида, смешивают с О, 079 мл (0,631 моль) М-этилморфолина и реакционный раствор охлажда45

55

9 9200 ют до -25 C. Полученную смесь добавляют к раствору смешанного ангидрида

Вос-Tyr(SO Na)-Met-Gly-0H. Затем смесь перемешивают 30 мин при -25 С и 4 ч при комнатной температуре. Выпавший в осадок амингидрохлорид отсасывают, растворитель удаляют в вакууме с помощью масляного насоса и вязкотекучий остаток растирают на .холоде со смесью н-бутанол - эфир о (1:1) . Твердое вещество отсасывают, тщательно промывают хлороформом и высушивают в вакууме над Р О, .

Выход: 0,650 r (88 )." Т.пл. 184186 С. (10 = -7,1) (C=0,25 в диметилформамиде)

Щ0 = 3,7 (C=0,25 в 1-1 0)

Аминокислотный анализ после щелочно- . го гидролиза: TyrSO q 0,88; Tyr 0,03; 20

Phe 0,9; Asp 1,0 . .Р< = 0,64;

RI, = 0,67.

Пример 4. О-сульфат-L-тирозил-L ìåòèîíèë-глицин-Ь-триптофил-L-метионил-Ь-аспартил-I,-фенилаланин- 5 амид-трифторацетат.

0,650 г (564 .-моль) Boc-Tyr(SCpa)—

Ме -Gly-Trp-Met-Asp-РАМН смешивают с 0,5 мл метоксибензола и О, 1 мл

1-меркаптоэтанола и затем 20 мин зо перемешивают с 125 мл 743-ной трифторо уксусной кислоты при 18-20 С. Реакционный раствор добавляют в двукратное количество смеси эфир — петролейный эфир (1:1) и отсасывают от рых35 лого осадка. Тщательно промывают осадок петролейным эфиром и высушивают в вакууме над Р Оц/КОН. Выход:0,550 г (853). Р „ = 0,„52 и 0,62 (около

204); Е = 0,57 и 0,77 (около 20 ).

Аминокислотный анализ после щелочного гидролиза: Тут(SO II) 0,68;

Тут 0,23; Asp 0,74; С1у 1,0; Ме

1,6; Phe 0,9; Trp 1,1.

Пример 5. N-сукциноил-О-сульфат-I.,-тирозил-L-метионил-глицин-L-триптофил-I..-метионил-L-аспартил-I.-фенилаланинамид.

0,550 г (0,00048 моль) продукта. полученного в примере 4, растворяют в 10 мл диметилформамида, при перемешивании смешивают с 181 мл (0,00144 моль) N-этилморфолина (никакое другое основание не применять!) и охлаждают реакционный раствор .до 0 C. Затем в течение

40 мин добавляют при перемешивании

0,062 г (0,000624 .моль) янтарного

53 10 ангидрида и одновременно добавляют по каплям 0,079 мл N-этилморфолина, Реакционный раствор перемешивают еще в течение 3 ч и оставляют на ночь при +4 С.

Растворитель удаляют в вакууме на масляном насосе при +40 С, и вяз. кий остаток растирают с холодной смесью н-бутанол - эфир, твердое вещество отсасывают, тщательно промывают тетрахлорметаном, эфиром и петролейным эфиром и высушивают в вакууме над Р Од . Выход: 0,588 r (911). Т.пл. 172- l75 С, Аминокислотный анализ после щелочного гидролиза: TyrSOq 0,72, Tyr 0,18; Asp

1,0; Gly 1,1; !let 1,6; Phe 0,93;

Тт1 0,75; Rp<= 0 53 и 0,70 (" 20 .);

О, 64; и О, 68. (20 о) .

Очистка гель-фильтрацией на сефадексе G-25.

Набухший в течение нескольких часов сефадекс G-25 в О, 1 н.растворе ацетата аммония . (прибавлениемаммиака к 1н. уксусной кислоте до рН 6,5) вводят в колонку длиной 120 см и диаметром 4 см. Загружают раствор

200 мг неочищенного дезаминоктапептида в 8 мл 0,1 н. раствора ацетата аммония и 2 мл диметилформамида и элюируют 0,1 н. раствором ацетата аммония. При скорости прохождения

15 мл/ч определяют концентрацию пептида измерением экстинкции при 280 нм (Uvicord), элюат собирают фракциями по 8 мл. Фрации 9-31 содержат дезамино-PZ-октапептид, фракции 32"

34 — десульфатированный побочный продукт. Выход 0,116 г (603) и

0,055 г (11>6/) десульфатированного гептапептида

fJ ) 0 — — 3,4 + 0,5 С = 0 25 в воде („) в = 9,4 + +1 С = 0,25 в диметилформамиде

Аминокислотный анализ после щелочного гидролиза, Тут(050 ) Tyr Asp Gly Met Phe Trp

0,80 0,08 1,0 1,0 1,64 0,90 1,8

Пример 6. N-этоксисукцинил-О-сульфат-L-тирозил-L-метионил-глицин-Ь-триптофил-L-метионил-Ь-аспар". тил-L-фенилаланин-амид.

0,190 r (0,167 ",моль) Tyr(OS0>)- 1et-Gly-Trp-Ме1-Asp-Phe NH (пример 4) растворяют в 10 Mjl диметил- . формамида и добавляют 0,0182 мл (О, 146 моль) N-этилморфолина. Реакционную смесь охлаждают до 0 С и ,О

Формула изобретения

11 92 д .:бав. ль т 0.059 г (0,182, моль) эфи ра 2,>4>5-грихлорфенил-этоксиянтарной ки <.1IÎ rfы >> I lс ремеши еЗа0T >0 мин Г1ри 0

> ;> ° и оставляют на 2 дня при комнатной темпера гуре. Растворитепь удаляют в

I3>> I< "гуме при +4,> с > ма сг1я н истый О с Га го

rGl< f ill BpI1p ют эфиром/г1етропейным эф31рои „твердое вещес гво отсасывают и промывают хлороформом, эфиром и пегролейнь.м эфиром. Выход: 0,146 г ,(75 3;.); !",,. =- 0,61 12в; йу, -- 0,70 ..I5i, десульфатированного, ацилированного гептапептида.

Очи<тка разделением противотоком.

l3 качестве разделительной системы используют хлороформ/метанол/0,1 н. ацетат аммония (1),1:8 ID). После

32 разделительных стадий и лиофилизации выход продукта составляет

843 (фракции 7 l-31} наряд с 152 десульфированного, ацилированного гептапетида (фракции 20-22). Кислотно-щелочное титрование и определе.ние сульфата (Ба$0>1) дают 903 или

923 вычислительных значений.

Пример 7. п-гидроксифенилацетил-О-сульфат-L-тирозил-L-метионил-1,-триптофил-Ь-метилнил-Е-аспартил-Г -фенилаланинамид.

О, 190 г (О, 167 моль) сульфата гептапептида (по примеру 4) растворяют в 10 мл диметилформамида, добавляют 0,0182 мл (О, 146 .моль)

М-этилморфолина и реакционную смесь охлаждают до 0ОС. Добавляют 56 мг (0,I82 моль) эФира 2,"1,5-трихлорФенил-и-гидроксифенилуксусной кислоты, перемешивают 30 мин при 0 С и два дня при комнатной температуре.

Растворитель удаляют в вакууме при

+45<>С, и маслянистый остаток дигерируют эфиром/петролейным эфиром (1:1) . Твердое вещество отсасывают и промывают хлороформом, эфиром и петролейным эфиром, Выход: 0,150 г (8И); Ер = 0,59 при Р = 0,69

15., десульфированного, ацилированного гептапептида. Очистку проводят методом противоточно1-о разделения.

Выход 80<, (фракции 74-31) наряду с

153 десупьфированного гептапептида (фракции 1 I 23). Кислотно-щелочное титрование и определение сульфата (БаЯО> ) дают 953 или 93< вычислен ных значений:

5<3С-Туг — МЕ -Яу -0(tL гО;",„коиг1лекс flf.fридин-Юg Ьос -Тцг (SO МЦ, -" Iet-Qr II OAt(I pg; Мс,0Н

0053 I 7 . Ьаг-Ту.(50 -Ь )-Met К -ОН(Я). Trp- Yie1 - К.зр - Phe I>IH; 80i

Синтез методом смешанных ангидридов гБее Tqf" (Ь0 МЬ) -tlag -С -тгр - Pet

-SI:Ip -pIIeЧН (g) ВЗ%

+1э/о TFe> г> Н500НЪ/HZ 1>T

1О

TgгФ5) l I -I:-Иц-71 р - Ме -Ksp-t HeNHz. tF

И)

91 4 LH CO

О ИМ

ГИ<- CO

60 / eecpcfgef< C I-сВ т1 /, Тg f- - Ме1 - ЗГИ -Тгр - IIISp -РЬейНе (5)

НДП-СН -0H -CO-Т г($0 ) -Met-С.(-МИ -4arl -Р пе IIIH

7S7o Н50е0 > O HH CO-<>" LÿH С<

I-I;L O-сО -LHq-ГНе-CD -Т г(SOj) - Yet -I % .14-TfP-Ме -k,sPPheNH а (6} аог — НО-С> Нч-СН -СО-0 -Сь H Ct„

Нч-СН -СО-Туг(ЯО )-МеЕ -ЬКц р "). Nijz (7, ЗО

1.Способ получения пептидов,содержащих сульфат тирозина 6-20 остатков

35 аминокислоты с этерифицированным серной кислотой тирозином,путем сульфирования защищенного пептидного остатка, содержащего тирозин, конденсации его обычными методами пептидной химии с аминогрупгой другого пептида, содержащего 2-14 остатков аминокислоты, и последующего замещения по 4 -аминогруппе после отщепления защитной группы, отличающийся тем, что этерифицированный серной кислотой по тирозину N-защищенный пептид содержащий 2-6 остатков аминокислоты, используют в качестве

50, промежуточного продукта.

2. Способ получения Х-Тут(БО )—

- 1ct -Иу-Ттр-l let-Asp-РЬе ИЕ, где:

Н О ООС,-CHе-CHð -ЬО-, ПО-СБН CI) Г-О

ЛООС-HC -015-СО и другие ацильные остатки по п,1, о т л и ч а ю— шийся тем, что защищенный трипептидный эфир У-Тут-Met-Gly-О-алкил сульфируют, алкилэфирную группу отСоставитель В. Волкова

Техред Т,Маточка Корректор Л, Бокшан

Редактор И. Митровка

Заказ 2262/23 Тираж 448 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий .

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 .

Филиал ППП "Патент", г . Ужгород, ул. Проектная, 4

13 92 щепляют омылением, защищенный сульфированный трипептид конденсируют с

Trp-Iht Asp-PheNfl< преимущественно методом смешанных ангидридов, и полученный после отщепления защитной группы гептапептид ацилируют при добавлении слабой органической щелочи, преимущественно N-этилморфолина.

° °

3, Способ по пп. 1 и2, отл и ч а ю шийся тем, что при перера ботке продукта после сульфирования используют воднощелочной буферный раствор, преимущественно. NH /NH C1.

4. Способ по п.2, о т л и ч а ю - шийся тем, что для выделения за. щитного сульфированного,трипептида используют смеси высших спиртов с

0053 14 уксуснокислым эфиром, преимущественно н-бутанолэтилацетат.

5, Способ по и ° 2, о т л и ч а юшийся тем, что, в качестве защитной группы используют третичнйи бутилоксикарбонил и ее отщепление от сульфированного гептапептида осу- .ществляют 75-853-ной трифторуксусной кислотой при добавлении и избытке в метоксибензолмеркаптоэтанола при комнатной температуре.

6. Способ по пп.1, 2 и g, о т .л и ч а ю шийся тем, что получаемые .при кислотной. обработке фракции де-. з сульфатированного пептида такой же аминокислотной последовательности. отделяют после ацилирования аминогруппы.