Способ получения полипептидов
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
Я llATEHTV
Союа Советских
Социалистических
Республик (») 884565 (61) Дополнительный к патенту (51) М. Кл.
С 07 С 103/52У
А 61 K 37/02 (22} Заявлено 15. 05. 78 (21) 2616245/23-04
16.05 ° 77;16 06.77 (23) Приоритет — (32) 21. 06, 77; 21. 06 ° 77
6061/77; 7402/77; 23.06.77;14.11.77 (31) 75,6/77; 7577/77; (33)
7513/77; 13862/77
Опубликовано 23.11.81Бюллетень № 43
Государственный комитет
СССР но делам нэаоретеннй н открмтнй (S3) Ь ДК 547. 964. .4.07(088,8) Дата опубликования описания 23.11.81
Иностранцы
Франсуа Кардино, Янош Плесс (Швейцария) (72) Авторы изобретения
Иностранная фирма
"Сандос АГ" (Швейцария) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ
- - н-cQ Ц(1
Изобретение относится к способу получения новых полипептидов - биологически-активных соединений, которые могут найти применение в медицине.
Известны способы получения пептидов путем отщемления защитных групп от соот вет ст аующи х з ащищенных по ами- ногруппе пептидов. Использование известного метода позволяет получить новые пептиды, обладающие интересными фармакодинамическими свойствами jl) .
Цель изобретения - получение новых биологически-активных полипептидов, расширение арсенала средств воздействия на живой организм. 15
Поставленная цель достигается способом получения полипептидов Формулы А-В-Clу-0- K, (g) где А - остаток Формулы
° Р р„
НО СН вЂ” С вЂ” СО—
ЯН7. где В»- водород;
1 водород или вместе с R
- СНл-СН -группа;
2 - водород, алкил (Ст ), алкенил (С ), ци кпопропилметил, циклобутилметил или R> COгде R g - остаток L-аминокислоты, L-аланин, L-глутамин, 1-метионин, L-тироэин, L-триптофил, L-gee aaha s, L-метилтриптофил или Ry- L-метионинсульфоксид, L-метионинсульфон, L-3,4-диоксиФенилаланин, причем свободные аминогруппы могут быть замещены алкилом (С1 <), причем, если В-0-аланин, R не может быть фенилаланином или тирозином, В - О-аланин, О-серин, D-метионин, О-метионинсульфоксид, 0-метионинсульфон, остаток aL"àèèíîмасляной кислоты (А1b);
D - -остаток формулы
884565
3 где Rq- водород, или метил;
Я вЂ” остаток формулы — N — CH — Сн 0Н
R) Rg где R>- водород
Яь- а) -СН СН(СН ) . б) -tH СН SCHg (n т 1,2)
Ч. (0) в) Я„вместе с х — — — СН
СН— Л (в=О или 1)
Ф
° (О) Ь при условии, что В - а) О-аланин, если Z (группа RICO - и/или Я„и R вместе - группа -СН -СН -, прйчем остаток А имеет 0-конфигурацию и/или
СН ОН, — 8 ОН ОН
26
Ь
4 0)Ь б) д-аминомасляная кислота, если
R g и Я вместе - группа - СН -СН и/или 6-СН2-СН -S-СНg (r - 1,2)
1 ф (о)г остатки А и 0 имеют конфигурацию или DL-ряда Я -конфигурацию L,D, или 0L-ряда, если Я „и Я вместе означают группу - СН -CHg-, А также ©
° может иметь 0-конфигурацию, заклю"чающимся в том,что защищенный полипептид с последовательностью аминокислот, отвечающих формуле I,ïoäâåðràþò деблокированию в безводной кислой среде.
Предпочтительным вариантом способа является использование в качестве кислой среды трифторуксусной кислоты в хлористом метилене.
В приводимых ниже примерах применены следующие сокращения:
АiЬ вЂ остат д -аминомасляной кислоты;
Вос - трет.бутилоксикарбонильная группа;
43
ДИФ " диметилформамид;
Dopa - остаток 3,4-диоксифенилалани на;
Leu-ОВ - лейцинольный остаток;
Ией(0)-OE - остаток метионинсульфоксида;
Net(0g),- остаток метионинсульфона;
Net-0 L - метионинольный остаток;
Ие (О) -ОВ - метионинолсульфоксид$5 ный остаток;
NePhp - остаток й-метилфенилаланина;. ф
MeTrp - остаток М- метилтриптофана;
MeTyr - остаток Й-метилтирозина;
0Np — 4-нитрофенокси-группа;
Pro-03 - пролинольный остаток;
ТФУ - трифторуксусная кислота;
ThZ-ОЮ-4--4 - оксиметилтиазолидинильный-3 остаток;
ThZ(O)-O9 - 4-оксиметилтиаэолидинилсульфоксильный-3 остаток.
Если нет дополнительных указаний, все остатки аминокислот, кроме остатка глицина, и все остатки аминоспиртов имеют L-.êîíôèãóðàöèþ. Аминоспирты принадлежат L-ряду в том случае, когда их СН ОН - группа занимает положение альфа - COOH - группы в соответствующей L-аминокислоте.
Пример 1. Н-Tyr-0-Met-GlyNePhe-Net-О1(трифторацетат).
7,5 г Boc-Tyr-D-Met-Gly-MePheMet-01 растворяют при комнатной температуре в 100 мл смеси трифторуксус-. ной кислоты и хлористого метилена, взятых в соотношении 1: 1. Через 5 мин раствор упаривают в вакууме и производят осаждение продукта диэтиловым
}эфиром. Получают указанное соединение, температура разложения которого - 90ОС, (* ) = -4,4 (с = 1,2 в уксусной кислоте, 953-ной).
Примененный в качестве исходного материала Вос-Tyr-0-Net-Glу-MePhe-Met-03 получают следующим сйособом. а) Вос-D-Met-Gly-ОН.
К 37 r Boc-D-Met-.ONp в 150 мл
1,2-диметоксиэтана прибавляют при комнатной температуре раствор 9 г глицина и 4,8 г гидроокиси натрия в 35 мл воды. Через 2 ч реакционную смесь разбавляют 300 мл воды и продукт несколько раз экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты Водную фазу покрывают этиловым эфиром уксусной кислоты и подкисляют 4 н. раствором серной кислоты. Органическую фазу несколько раз.промывают разбавленным раствором кислого сернокислого калия и водой, после чего отгоняют растворитель в вакууме. Остаток кристаллизуют из смеси этилового эфира уксусной кислоты и петролейного эфира. Температура плавления .продукта
126 C-, (d ) о= + 12oC (с = 1,1 в диметилформамиде). б) Вос-Туr-D-Меt""Glу-OH.
К 4 г Вос-Tyr-Ойр, растворенным в
40 мг диметилформамида, добавляют при комнатной температуре раствор, содержащий в 40 мл диметилформамида
5 8845
3,8 г Н-0-Net-Gly-ОН (трифторацетат), который предварительно получают из
Вос-D-Met-Gly-ОН посредством обработки последнего смесью трифторуксусной кислоты и хлористого метилена, взятых в соотношении 1:1, и 3,3 мл триэтиламина. Через 2 ч раствор упаривают в вакууме, полученный остаток разбавляют 150 мл воды и производят обработку реакционной смеси так, как описано в пункте а. Указанное соединение кристаллизуют из смеси этилового спирта и петролейного эфира. Температура разложения продукта 195 С;(с - )> =
+11,6ц(c = 1,0 в диметилформамиде). с) Boc-HePhe-Het-ОВ.
Раствор 3,1 r Boc-MePhe-ОН в 30мл тетрагидрофурана охлаждают до -20 С при перемешисании добавляют к нему
1,45 мл N-этилморфолина, затем добав- 0 ляют 1,45 мл изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты, после чего продолжают перемешивание реакционной смеси в течение 5 мин при -20 С. Затем
0 к реакционной смеси прибавляют охлажденный раствор I,80 г метионинола в
8 мл тетрагидрофурана и реакционную массу выдерживают в течение 2 ч при температуре от -5 до 0 С, после чего перемешивание продолжают в течение ЗО
2 ч при комнатной температуре.. Непосредственно после этого реакционную .массу разбавляют 350 мл этилового эфира уксусной кислоты, раствор несколько раз промывают водой,, 1 н. у лимонной кислоты, 103-ным раствором кислого углекислого калия, 303-ным раствором хлористого натрия. Затеи органическую фазу сушат сернокислым натрием, упаривают раствор, получают 4о
Вос-HePhe-Met-OE в виде аморфного продукта; (* ) = -54 (с = 1,24 в метиловом спирте). б) Н-MePhe-Met-OE (трифторацетат)..
Раствор 4,3 г Вос-HePhe-Met-OE в м
20 мл хлористого метилена, 5 мл СН -S-CH -СН и 0,2 мл HS-СН -СН -ОН смешивают при О С с 40мл 983-ный трифтор-. уксусной кислоты. Реакционную смесь выдерживают в течение 1,5 ч при ком- о натной температуре, затем упаривают в вакууме до 5-10 мл. Продукт дважды переосаждают из смеси диэтилового и петролейного эфиров. Иаслообразный продукт сушат в глубоком вакууме.Получают Н-MePhe-Met-OE (трифторацетат) в виде аморфного продукта; .(с . )1 О
+ 3,2. (с = 0,98 в метиловом спирте) . е) Вос-Туг-D-Me t-G l y-NePhe-Met-О В.
65 &
К 4,7 г Boc-Tyr" D-Met-Gly-OH, 2,7 r l-оксибензотриазола, 4,1 r
Н-МеРйе-Net-Оl (трифторацетат) и
1,1 мл N-метилморфолина в 40 мл диметилформамида прибавляют при 0 С, 2,3 г дициклогексилкарбоди;ч да.Реакционную смесь выдерживают в течение
1 ч при 0 С и в течение 15 ч при комнатной температуре, осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме, полученный остаток растворяют в этиловом эфире уксусной кислоты и раствор несколько раз промывают разбавленным раствором кислого углекислого калия, соляной кислотой и водой, после чего растворитель отгоняют в вакууме.
Полученный остаток чистят с помощью хроматографии на колонке, заполненной силикагелем, используя для элюирования смесь хлористого метилена и метилового спирта. Получают указанное соединение в виде аморфного продукта; (* ) = - 23,3 (с 1,2 в диметилформамиде), Пример 2. Н-Tyr-0-Мег{О)-Glу-MePhe-Het(О)-ОE (трифторацетвт).
7,9 г Boc-Tyr-0-Met(О)-GlуHePhe-Net(O)-0l растворяют при 22 С в 100 мл смеси трифторуксусной кислоты и хлористого метилена, взятых в соотношении 1:1. Через 5 мин раствор упаривают в вакууме и осаждают указанное соединение диэтиловым эфиром; (д ) > = -3,1 (с = 1 в 953-ной уксусной кислоте).
Примененный в качестве исходного материала Вос-Tyr-0-Met(О) -Glу-MePheИей(О)-01 получают следующим способом.
К раствору 7,5 г Вос-Tyr-D-HetGly-MePhe-Met-O1 в 75 мл уксусной кислоты при 22 С прибавляют 2,0 мл
11 M перекиси водорода. Через 5 мин реакционную смесь вводят при перемешивании в 1,5 л диэтилового эфира и отделяют выделившийся в осадок неочищенный продукт фильтрованием.
Неочищенный продукт чистят с помощью хроматографии на силикагеле, используя для элюирования смесь метилового спирта и хлористого метилена. Указанное в заголовке соединение получают в аморфной форме, причем продукт тотчас подвергают обработке трифторуксусной кислотой °
По аналогиии с приведенными примерами, при использовании соответствующих исходных соединений, получают пептиды, укаэанные в табл. 1 и 2.
884565
Т а б л и ц а 1
Соединение формулы А " 8 - Gly - 0 - Е
Пример форма с
-соли АсОН град.
954
0- Me t (0) MePhe
3 H"Tyr
4 Н-Tyr
Н-ту«
ТФУ -6,9 1,2
ТФУ -3,6 1,2
ТФУ -3 1 1
ТФУ -б 5 1
HePhe
0-Me t (Og) HePhe
О-Met(0) MePhe б Н"MeTyr
НС1 -22,2 2,7
7 Н-Ala-Tyr
B Н-Dopa-Tyr
9 Н-Gly-Туг
10 Н-Met-Tyr
0-Аl а
0-Аl а
0-А1а
0-Аl а
MePhe
MePhe
MePhe
Phe
11 Н-Met(0)-Tyr 0-Аlа
Phe
0-А1 а
O-Ala
0-Аl а
HePhe
Phe
Thr-Ol ° ТФУ +25,3 1,0
Phe
ТФУ +1,0 0,5
ТФУ +28,6 1,0
ТФУ +2 9 11
Phe
0- А l a
16
0-А) а
0-Met
MePhe
Phe
ТФУ +25,5
0-Ме t (О) Phe
MePhe
MePhe
MePhe
Н-Phe-МеТуг 0-А1а
Н-MePhe- Ty r 0-А l a
H-МеТгр-Tyr 0-Аl а
20
ТФУ 15, 1
ТФУ +17,2 1, 0
ТФУ -8,1 1,0
Phe
Ai b
Н-Tyr
23 H"Tyr
MePhe
0-Ser
Н-Trp-Tyr
Н-Tyr
Н-Туг
Н-Tyr
Н-Tyr
Н-Tyr
Н-Tyr
Met" 01
Met(0)-Ol
Het(0)-01
Met(0)-0l
Met(O)-0l
Met (0) -О l
Мей (О) -Ol
Leu-0l
Leu-Ol
Met(O)-01
Thr(0)-Ol
Pro-01
Pro-O1
Pro-01
Pro-01
Met(O)"0l
Меt(0)-Ol
Ме (О)"01
Met(O)-01
Met(0)-0i
НС1 -10, 3 2,2
НС1 -9,2 2,1
ТФУ +23,8 1, 2
ТФУ +24 9 1,1
НС1 +5,9 0,85
ТФУ +23,7
НС1 -53,5 0,9
ТФУ -18,2 1,05
884565
10. -1
iz
CO-D-Ala-Gly"MePhe-Met(0)-О1 (Р-форма) Э
Соединение формулы
ЧО г г фо " (+ Pa
1 соли Р
Пример, N а в
АсОН 95й
TII)Y -35, 7
НС1 -18,9
25 сн -с :
0,55
Формула изобретения
1. Способ получения полипептидов формулы 1
R 4- водород;
R — водород или вместе с Я,1-СН)1-СН g группа;
Z - водород, алкил (С g ), алкенил (С ), циклопропилметил, циклобутилметил или RgCO-, где Я - остаток б-аминокис35 лоты: L-аланин, L- глутамин, -метионин, L-тирозин, L-триптофил, -фенилаланин, L ìåтилтрифтопил или Яо,- L-метио40 нинсульфоксид, ).-метионинсульФон, L-3,4-диоксифенилаланин, причем свободные аминогруппы могут быть замещены алкилом (С„ ), причем В - О-аланин, R не может быть фенилалани45 ном или тирозином;
В - D-аланин, D-серин, О-метионин, D-метионинсульфоксид, 0-метио нинсульфон, остаток d -аминомасляной кислоты (AIЬ)
0 - остаток формулы-й-СН вЂ” CO
I д СИ I
55
A-В-Gly-D- a
t где А - остаток формулы
Rg
НО Сн — С вЂ” Co—
NHZ где R4 водород или метил," остаток формулы — 8 — СН вЂ” СЦ ОН l
1, где Яу- водород;
R - а) -СН <- СН
СН б) -CH I (0) rI в) Rg вместе с R< -МСН5 (Ь Оили 1) (d)6 при условии, что В а) О-Ala, если Z - группа R3CO- и/или R1 и Я вместе — группа - СНу)-СН, причем А имеет D-конфигурацию и/йли Е.-.N СН ÎÍ,-N СН ОН(Ь=Оили1) 1Р)е 6) Aib если н и iI вместе - группа -CH -СН - и/или f -CH -СН <>"СН Я. Хт 5 (OlI" (г 1,2); остатки А и О имеют конфигурацию L или ÎL-ряда; ): -конфигурацию L D или 01.-ряда, если Я и Rg вместе означают -СН -СН -групйу, А также может иметь О-конфигурацию, отличающийся тем,что, замещенный полипептид с пьследоваTeJllH0CTb)O BMNHOKHCJl0T отвечающих формуле I, подвергают деблокированию в безводной кислой среде. 2. Способ по и.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве безводной кислой среды используют трифторуксусную кислоту в хлористом метилене, Приоритет по признакам; 16.05.77 при А - Я,), R - все указанные значения; 2 -R)CO, где Rg- L-аланин, L-глутамин, L-метионин, L-триптофил, L -фенилаланин; В - О-метионин, О-метионинсульфоксид, О-метионинсульфон; О - R -водород, метил; 6 - Ру-водород, R6-СН СН(СН, -CH CH SCHg, где и 1 или 2, (O)n 16.06 ° 77 при A - Р„и Р < — все указанные значения; Z - Р СО, где Rg - 1-аланин, L- глутамин, L-метионин, L-триптофил, L-фенилаланин, L-метионинсульфоксид, L- ìåòиони нсул ьфон; В - 0-аланин, 0 - -водород, метил; Я - Р - водород, Р6-СН СН (СН $, -СН СН -СН, где и 1 или 2. (о)„
