Способ определения инсулина

 

СОЮЗ СОЕЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК зж G 01 N 21/78

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТШИЙ И ОТКРЫТИЙ

< 21 ) 3364043/23-04 (22) О1. 12. 81 (46) 23.07.83; Бюл. М 27 (72) В. Г. Цой, В. К. Пиотровский, В.И, Метелица и И.Ф. Долманова (71) Всесоюзный кардиологический .научный центр Академии медицинских наук СССР и Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. М.В. Ломоносова (53) 543.42.063 (088.8 ) (56) 1. Полюдек-Фабини P., Бейрих Т, Органический анализ. Л., "Химия", 1981, с. 174.

2. Коренман И ° М. Фотометрический анализ. М,, "Химия", 1970, с. 282 ,(прототип).

„„SU„„1030704 (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНСУЛИНА, с использованием измерения оптической плотности раствора, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности и селективности способа, вводят пробу анализируе- . мого вещества в раствор, содержащий гидрохинон и сульфат меди, к полученной смеси добавляют боратный буФерный раствор и перекись водорода с последующим измерением изменения оптической плотности полученного раст. вора.

1 103

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способа м определения лекарственного препарата - инсулина.

Известен способ определения инсулина путем обработки анализируемого вещества сначала раствором нингидрина в метилцеллоэольве в присутствии цитратного буферного раствора, затем раствором цианида калия при нагревании до 100 С с последующим добавлением к полученному раствору этилового спирта и его фотометрированием l„1 1 .

Недостаток данного способа состоит в его сложности, связанной с многостадийностью.

Наиболее близким к изобретению по техническо" сущности и достигаемым результатам является способ определения инсулина путем обработки раствора анализируемого вещества щелочью и сульфатом меди с последующим измерением оптической плотности полученного окрашенного соединения

С23

Недостатком известного способа является его низкая чувствительность (0,5 г ) и неселективность, связанная. с тем, что определению мешают все белки и полипептиды.

Цель изобретения состоит в повышении чувствительности и селектив ности способа.

Поставленная цель достигаетСя тем, что согласно способу определе.ния инсулина, вводят пробу анализируемого вещества в раствор, содержащий гидрохинон и сульфат меди, к полученной смеси добавляют боратный буферный раствор и перекись водорода с последующим измерением изменения оптической плотности полученного раствора.

Способ определения инсулина в лекарственных препаратах осуществляют следующим образом.

Вводят аликвоты стандартного раствора в реакцию окисления гидрохинона перекисью водорода, каталиэируемую ионами Си2+, Определяют скорость этой реакции по изменению оптической плотности во времени, выражая ее как тангенс угла наклона прямой в коорди0704 натах оптическая плотность - время (ted). Используя полученные величи-. ны (tq ) pля различных аликвот стандартного раствора строят градуировоч-, ный график в координатах тангенс угла наклона - концентрация инсулина, по которому определяют содержание инсулина в исследуемых образцах. При определении содержания инсулина в

1О образцах лекарственных препаратов для перорального, в частности, сублингвального применения, необходимо при построении градуировочного графика вводить в реакционную смесь аликвоту

15 водного раствора нплацебо", равную аликвоте водного раствора исследуемого образца. Время, затрачиваемое на анализ одного образца составляет

5 мин. Метод позволяет определить

20 не биологический эффект от введения инсулина, а его количественное содержание в водных растворах лекарствен" ных форм.

Пример 1, Определение co2s держания инсулина в образце препарата для перорального применения. По своему составу препарат, содержащий инсулин, и "плацебо" идентичны, эа исключением активного вещества. В качестве стандарта используют коммерческий препарат (40 и.е./мл ).

А, Построение градуировочного графика.

В спектрофотометрическую кювету

35 (0 = 2 см ) вводят 0,7 мл водного раствора гидрохинона (0,23)„ 1,0 мл водного раствора Си50 6 .10 М/;

1,0 мл водного раствора "плацебо" (1 пластинка в 25 мл ), боратный буферный раствор (рН = 7,8). до общего объема 10 мл, (О-40)мл стандартного раствора инсулина (40 и.е./

/1 мл ); 0,3 мл концентрированной

Нг02 В момент введения Н202 включа45 ют секундомер и измеряют значение on тичеокой плотности на ФЭК-56М (Ф H 5) через каждый 15 р от 30 до 120 с.

Каждый раз после проведения измерений кювету многократно промывают

0 бидистиллированной водой. Данные для определения содержания инсулина в образце препарата для перораяьного применения даны в табл. 1.

103070) 6

Продолжение табл фа м

Заданная концентрация инсулина, 0 04 08

1,6

Исследуемый образец и.е. в

10 мл реакционной смеси

Значений оптической плотности (и =. 3) Среднее значение

tgcLх10 7,2

6,2

5,3

6,6

Б 10 . 0 1О

0,16

0,10

0,22

0,05 — . 10

Уп (.Р"- 0,95) 0,40

0,25

0,13

На основании измерений величин оптической плотности растворов строят прямую в координатах оптическая плотность — время и определяют изменение оптической плотности дА эа еди" ницу времени aV или, что тоже самое, тангенс угла наклона прямой tpd. В табл. 1 приведены значения tg, приведенные в 1 мин (ai= 60 с), как обычно принято в кинетических методах анализа, а также средние значения 1@с), полученные по результатам трех измерений, Градуировочный график строят, откладывая по оси ординат значения tgc4 а по оси абцисссоответствующие известные концентрации инсулина.

Уравнение градуировочной прямой

Cga-х 10 = 7,14-1,16 Синс.

Предел обнаружения - 0,26 и„е/

/10 мл, что соответствует 6, 5 и.е. /

/пл, 5. Определение содержания инсулина в образце препарата для перорэльного применения.

В спектрофотометрическую кювету (0 = 2 см ) вводят 0,7 мл водного раствора гидрохинона 0,23 ; 1,0 мл водЗ5 ного раствора CuSO (6 .10 N ), 1,0 мл водного раствора исследуемого образца (1 пластинка в 25 мл ); боратный буферный раствор (рН = 7,.8) до общего объема 10 мл; 0,3 мл концентрированной Н О2. В момент введения

Н О2 включают секундомер и измеряют зйачения оптической плотнЬсти (табл. 1). Рассчитывают занчения

1с о и определяют содержание инсулина в образце по полученному ранее градуированному рафику С„= 12,5 и.е,/

/пл.

Пример 2 ° Определение содержания инсулина в коммерческом

5О препарате для инъекций с содержанием инсулина 40 и.е./мл, В качестве стандарта использован кристаллический инсулин (25,2 и.е.), А, Построение градуировочного

H графика.

В спектрофотометрическую кювету (0 = 2 см )вводят 0,7 мп воднс1го раствора гидрохинона (0,24); 0,2 мл .

7 водного раствора Cv50 (6.10 М); боратный буферный раствор (pH = 7,81 до общего объема 10 мл (0-100)мл стандартного водного раствора инсу1030704 8 лина (5 и.е./мл), 0,3 мл концентрированной Н О . Далее поступают, как описано в примере У 1.Значение оптической плотности иф Ф приведены в табл.2.

1030704 l0

)К

tD

О) «Г

cf )((tD t))

ttI о а.

U lQ .ж о сч м

О с Т л

C) сч

lA сч с) t

1

1

t

1

1

1

1

1.

1

t

t

1 О сл . ъО О с!1

ЧЭ сч о

6 со л О

Ю

l

tIl

Q. ((3

X K

X !II с(б «!

Щ X

1 )Х э о о.

«Г

О М

:)) о

X It!.

X ф е

0C X Q

X X °

«3 Ц X

Ьб)

° .фб

1

С

I.

t(I1

«)!

XI

1 1

1О(I сС(1

1 б- I

1

I

I

I

t

l

I

1 !

1

t

1

1

1 .1

1

1

1

1

1

I

1

1

1

i

1

I

1

1

I

I

I ! !

I

1

I

1 ! !

l

I

I

1

I

3 ! ! ! ! . 1 ! ! !

I!

I

1

I

1

1 !

I

I !

t

1

1

1

1

1

I

1

I

t

I !

I

t

1 !

1

I

1

I

1

I

1

1

1

1

l

1

l

I

I !

I

I

I !

1

I !

1

I

I !

1

1

1 !

I !

l !

I ! !

X I

О

Об 1

X о

1

I

1

t!

1

1!

1

I

1

1

I

- сЧ I

1 (! с

X I

1- 1 о о х !

I- I о

С„ I! 1

)X I о (С о

Q 1

3 I

X 1

I- 1

1: I

О 1

S 1 х

С() 1

СС(I

X 1

СО 1

I

1

I (I (1

1!

I!

I б о !

О СО О т сл л со сч m ч:) !. О

<Л СО СО О

v3 оъ .

1f со со ч9 ОЭ а о

<чЪ сб О сч сч

О «- сЧ а сч сч

О СЧ т сч

О) с:)

QQ t ° а

О СЧ М! в

О Е= М

О e a сч м м

l

1

1

I

1

1

1

I

1

1

1

I

1

1

1

1

1

1

1 ! !

I, )

1

I

I

t

1

1

1

1

1

t

I ! !

I

1

1

I

- Ф сс\

-з

О л

Оо

-а. л

1Л сч и ч:) л

\1 \

11 10

Уравнение градуировочной прямой

tg.d x lO = 6,7-3,8 Синс.

Составитель.6„ Хованская

:-Редактор Л. Гратилло Техред(Ъ.Далекорей Корректор,B Бутяга

Заказ 5202/44 Тираж 873 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Предел обнаружения - О, 1 и.е./

/10 мл, Б. Определение инсулина в образце коммерческого препарата для инъекций.

В спектрофотометрическую кювету (1 = 2 см ) вводят 0,7 мл водного раствора гидрохинона (0,23); 0 2 мл водного раствора CuSO (6 10 М );

70 мл водного раствора исследуемого образца инсулина, разбавленного в

10 раз, боратный буферный раствор (рН = 7,8 ) до общего объема 10 мл;

30704 12

0,3 мл концентрированной Н20 . В момент введения Н О 2 включают секундомер и измеряют значение оптической плотности на ФЭК-56И через каждые

15 с от 30 до 120 с. В табл. 2 представлены данные для определения содержания инсулина в коммерческом препарате для инъекций, Далее поступают, как описано в

10 примере 1. Содержание инсулина определяют rio градуировочному графику

С „ = 44 и ° е./1 мл исследуемого раствора(0,31 и.е./10 мл ).

1 Предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность способа и его селективность.