Способ получения препарата бактериальной люциферазы

 

СОКИ СОВЕТСКИХ

ONHVNЮ Н

РЕСПУБЛИК

{ЯВ ИИ

3{53} C 2 N 9 02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЙ - : - . "",, "3 ñ %

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21 ) 3402201/28-13 (22) 21.01.82 (46) 15.08.83. Бюя. 9 30 (72) В.В.Иежевикин, Е.С.Высоцкий, В.В.Заворуев и 3.К.Родичева (71) Институт биофизики Сибирского отделения AH СССР (53) 527 .15.07(088.8) (56) 1. J.Lee, С1. Murphy, G.L.Faini, Т.Ь,Вапсош. Bacterial bioluminescence and its application to analyti. cal procedures. ln "Liquid scintil " 1

lation counting", Нею-York, Academic Press inc. 1974, р.4 03-420.

2. Авторское свидетельство СССР

Р 785318, кл. С 12 и 9/02, 1979.

3. Воробьева Т.И., Высоцкий Е.С., Эаворуев В.В., Межевикин В.В. Регу ляция синтеза люциферазы у photobacterium mandapamensis.-"Ìèêðoáèoëoгия", 1980, т. 49, 9 4, с.517-520.

4. Фиш A.M. Исследование некоторых сторон метаболизма светящихся . бактерий в непрерывной культуре.

Автореф. канд. дис., Красноярск, 1969.

5. Гинсберг Г. -В кн. Методы вирусологии и молекулярной биологии, М., 1972, с.322. (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА.БАКТЕРИАЛЬНОЯ ЛЮЦИФЕРАЗЫ, включающий выращивание культур бактерий рода Photobacterium на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, кислорода и мине.ральные соли, в аэробных условиях, отделение клеток, их разрушение, отделение клеточных оболочек и колоночную хроматографию ферментсодержащего раствора, о т л и ч а ю щ и йся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве наполнителя для колонок используют СаНРО Н О, полученный после хроматографии элюат концентрируют и хроматографируют повторно.

2. Способ по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что элюцию люцифе- /фью разы при хроматографии осуществляют линейным градиентом K/Na фосфатного С" буфера рН 6,6-7,0 в пределах концентраций 0-Ор1 М.

1035062

Изобретение относится к медицинс- кой, микробиологической и ферментной п ромышленности и может быть

1 применено в биохимии, .медицине, микробиологии и аналитической химии

-для определения содержания ряда метаболитов, таких, например, как флавинмононуклеотид, пиридиннуклеотиды, альдегиды, и т.д., а также для определения активности ферментов, связанных с метаболизмом этих ве.ществ.

Известен способ получения препарата бактериальной люциферазы, включающий выращивание культуры Photobac.

ferium fischeri на жидкой питательной среде, содержащей источники уг-. лерода, азота, кислорода и минеральные соли, в аэробных условиях в течение 24 ч с последующим отделением клеток, разрушением их, отделением клеточных оболочек, фракционированным осаждением белков высаливанием сульфатом аммония при насыщении 3075Ъ, .отделением осадка фермента, растворением его. в буфере и очисткой

его путем колоночной хроматографии в присутствии буфера на сефадексе

G-75 и диэтиламиноэтилцеллюлозе ДЕАЕ-321 и диэтиламиноэтилсефадексе

A-50 11).

Недостатком этого способа является низкая удельная активность получаемого препарата люциферазы (для

ГМИН вЂ” 9 10" квант, с "мк " .

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения препарата бактериальной люциферазы, включающий выращивание культуры светящихся бактерий Photobacferium fischeri на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, узота, кислорода и минеральные соли, в аэробных условиях, отделЬние клеток и их разрушение (обычно в результате обработки детергентом Тритон Х-100 в количестве 0,5-1,0Ъ от веса клеток и действия ультразвука), отделение клеточных оболочек, фракционированное осаждение люциферазы сульфатом аммония при насыщении 78-80Ъ, отделение осадка люциферазы, растворение его в буфере, диализ на сефадексе G-75, колоночную хроматографию на сефадексе G-75 и триэтиламиноэтилцеллюлозе. Хроматографию осуществляют в К/Na-фосфатном буфере (рН 7,0 0,02 M.). Люциферазу с колонки, наполненной триэтиламиноэтилцеллюлоэой, элюируют линейным градиентом NaCl в интервале концентРаций 0-0,5 М в К/Na-фосфатном буфере. Полученный элюат пропускают через колонку с сефадексом G-25 для удаления солей и перевода фермента в летучий буфер - триэтиламин-НС1 (0,01 М, рН 8,8), а затем лиофилизи« руют. Процесс выращивания ведут.обычно в течение 9-11 ч на среде следующего состава, весЪ: N HPOp

0,7-1,0; КН РО, 0,1-0,2;(NHg) НРО4.

0,05-0,07 МАЗО» 0,01-0,02; пептон

1,0-1,5» NaCl 28-33, остальнре дистиллированная вода.

Активность полученного препарата с FMNH 1, 75 10 квант с мг " (2).

Недостаткоми этого способа являются относительная сложность спосо-, 10 "ба, связанная с тем, что получение препарата включает четыре колоноч-, ных стадии, причем в качестве наполнителей для колонок используют импортные материалы, что значительно удорожает получение люциферазы.

Цель, изобретения — упрощение способа.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения препарата бактериальной люциферазы, включающему выращивание культуры светя1цихся бактерий рода Photobacterium на жидкой питательной среде, содержащей источники, углерода, азота, кислорода и минеральные соли, в аэробных условиях, отделение клеток, их разрушение, отделение клеточньв оболочек и колоночную хроматографию ферментсодержащего раствора, в качестве наполнителя для колонок используют СаНРО4 Н О (брушит), полученный после хроматографии элюат концентрируют и хроматографируют повторно.

Элюцию люциферазы при хроматогра35 фии обычно осуществляют линейньм граднентом К/Na фосфатного буфера

РН 6,6-7,0 в пределах концентраций

0-0,1 М.

Способ обеспечивает упрощение процесса выделения за счет использования легкодоступного наполнителя для колонок, который может быть легко приготовлен в обычных лабораторных условиях, при этом уровень активности получаемого препарата не уступает активности известногб.

Предлагаемый способ получения препарата люциферазы заключается в следующем: выращивают культуру светящихся бактерий, в частности, Photobacterium leioqnathi на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, кислорода, и минеральные соли, в аэробных условиях, отделяют клетки, разрушают их известными методами, удаляют клеточные оболочки, полученный раствор хроматографируют на брушите, элюат, содержащий люциферазную активность, концентрируют и хроматографируют повторно на этом же адсорбенте. Активность препарата измеряют по известной методике 53 ).

Калибровку фотоумножителя ФЭУ-64 проводят известным способом Г4 1

3 10350

Активность полученного препарата

ic FNNH не ниже 1,8-2,0 .10 квант.с"мг

Составитель О.Скородумова

Редактор A.Авраменко Техреду.Костик Корректор В. Бутяга

Эаказ 5759/23 Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва; Й-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Пример . Для получения пре парата бактериальной люциферазы

aacnom*eyer Photobacterium leioqnathi 5. . штамм 262 иэ коллекции Института биофизики СО AH СССР. Культуру

Photobacterium leioqnathi предвари- тельно выращивают на качалке на сре- ° .де следующего. состава в r/ë: NaC1 )Q

30,0; ХН РО 1,0; Яа НРО,,12Н О 6,0; (NHg)j,ЯРО< д,5; МЦЯО4. 7Н О 0,2к бактопептон 10,0, глицерин 3,0; во- . да дистиллированная переносят стеiрилъно в ферментер 01йгойетво (LKB, Швеция), чтобы исходная плотность эасева составляла около 2-3 10 клеток/мл и осуществляют ферментацию в течение 3,5 ч при 27 + 0,2 С. В. конце ферментации клеткй отделяют цеитрифугированием при 10000 ох х 10 мин, отмывают холодным 33-ным раствором NaCl и хранят до использования в морозильной камере бытового холодильника. Для получения препарата люциферазы берут 10 г биомассы светящихся бактерий, заливают холодной дистиллированной водой в соотношении 5 мл воды на 1 г биомассы и разрушают их трехкратным замораживанием — оттаиванием, кле- 30 точные обломки осаждают центрифуги..рованием 10000 х 25 мин, а супернатант, содержащий люциферазу, наносят на колонку с брушитом (2,5 х х 20 см). Колонку предварительно уравновешивают дистиллированной водой. Брушит готовят по известной методике (5 ). После нанесения супернатанта колонку промывают дистиллированной водой до полного выьывания белка, не сорбирующегося на брушите в данйых условиях. Лоциферазу злюируют. линейным градиентом K/Na фосфатного буфера (pH 6,8) в пределах концентраций 0-0,1 М. Градиент .создают с помощью смесителя Ultrograd

:(ЬКВ, Швеция). Скорость прокачивания буфера через колонку поддерживают с помощью перистальтического ,насоса на уровне 50 мл/ч.. После

) элюирования фракции, содержащие активность, собирают. и концентрируют с помощью аппарата для ультрафильт. рации ФМО2-200 (возможно концентрирование высаливанием сульфатом ам.мония) на мембране СМ 18 до 15 мл хроматографируют повторно. Все операции выполняют при температуре не выае 4оС. При хроматографии полученного препарата на ультрагеле ACA-44 наблюдается один симметричный пик, причем распределение белка и активности-совпадают. Молекулярный вес этого белка, определенный с помощью набора белков фирмы "Serva" около

80000 дальтон. При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата Na наблюдается только две полосы с суммарным молекулярным весом также около 80000 дальтон. Чистота полученного препарата не менее 95%. Активность препарата в данном примере 1,81- 10 квант. с мг при измерении с ГМЙН1 и миристиновым ,,альдегидом.

Таким образом, предлагаемый спо-! соб позволяет получить препарат бактериальной люциферазы, по активности не уступающий препарату люциферазы, описанному в прототипе. Предлагаемый способ более прост и не требует импортных наполнителей для колонок, что удешевляет получение препарата.

Помимо Photobacterium leioqnathi ,способ пригоден для выпеления люциферазы из светящихся бактерий

Photobacterium phosphoreum и Вепее

kea Ьагчед1. Однако л оцифераза из этих видов характеризуется более низкой активностью,