Способ определения в кормах микотоксина патулина
l.cnOCOB ОПРЕДЕЛЕНИЯ В КОРМАХ МИКОТОКСИНА ПАТУДИНА, включающий экстракцию образца корма гексаном и этвлапётатом, пропитку полученным экстрактом антвбиотяческЕх писков и юс наложение на засеянный тест) Микроорганизмом агар, о т л я чающийся тем, что, с палью повышения чувствительности способа, в качестве тес1 -микроо(ганизма испот зуют штамм EcViericVua . Способ по п. 1, о т л в ч а ш и и с я тем, что, с целью двфферевциации патулина в других антибиотических веществ, дополнительно .проводят хроматографию экстракта и валожеине хроматеграмм на arapi э&сеянный указанным тест микроорганизмом EcVieHcl iQ coti М4
.СОЮЗ СОВЕТСКИХ
ОШ
РЕСПУБЛИК (!9) (10
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3395369/30-15 (22) 01.02.82 (46) 23.08.83. Бюл. М 31 (72) Л. И. Погребняк и А. Ф. Ображей (7. 1 ) Украинский научно-исследователь» ский ветеринарный институт (8 576. 8 (088. 8) (56) 1. Stott W., Bul. erman Z. Hicro-.
biolbaical assay оФ patulin using
Bacillus meciaterium.-"Jornal of association of official analytical chemisis"в 58е,.497- 99е 1975. (54)(57) 1. СПОСОБ ОПРЕ,ПЕЛЕНИЯ В
КОРМАХ МИКОТОКСИНА ПАТУЛИНА, включаюший экстракцию образца корма. ° * " Р—В.З =Р
С 126, 1/02 гексаном и этилаютатом, пропитку полученным экстрактом антибиотическик дисков и их наложение на засеянный тесъ микроорганизмом агар, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышении чувствительности способа, в качестве тес юмикроорганизма испогп .зуют штамм ЕсйЕчсЪ а Cqti МФ
2. Способ по н. 1, о т л и ч а ю ш и и с я . тем, чтб, с целью дифферен» циации патулина и других антибиотических вешеств, дополнительно проводят хроматографию экстракта и наложение хромато грамм на агар, засеянный указанным тестмикроорганизмом ЕсЬег1сМа сеР М4.
l0363
1
Йзобре тение относится к метоцам микотоксикологических исследований кормов дпя животных.
Известен способ цпя определения биологически активного патулина, за ключаюшийся в том, что культурЬй ÜaслИ06 tnggQtgl 1IIN ИКИКЕ 1366 ино» купируется жидкая питательная среда ТДГ, состоящая из 0,5 г триптона, 0,25 г дрожжевого экстракта и 0,1 г 10 глюкозы, растворенных в 100 мл дистиллированной воды. Инокупированная среда инкубируется в термостате в течение 15»20 ч, Конечная густота микробных клеток в среде проверяется с j5 помощью спектрофотометра. Коэффициент поглощения (T) при использовании кювет 1 см и длине световой волны 520 нм должен равняться 70%, .В случае, если густота культуры не соответствует этим показателям, ее разбавляют физиологическим раствором, 2% инокулята IIoбавляют в среду ТДГ, содержащую 1% агара, и разливают ее в чашки Петри по 10 мл. Температура TgI»aãapà при введении инокупята цолжна быть не бо лее 50 С.
На антябиологические диски размером 6,35 мм наносят растворенный стандарт патулина в количествах ® 3, 5, 10 и 20 мкг, экстракт исследуемого образца яблочного сока или зерна в количествах 1, 5, 10 мкл, а также 20 мкл растворителя, применяемого цля раство» ренин микотоксина патулина и экстрагирования исследуемых образцов.
Диски раскладывают на чашки Петри, проводят предварительное преинкубирование в термостате при 5 С в течение 45 мин, а затем инкубируют в термостате при
37 С в течение 12-15 ч. Измеряют эо ны задержки. роста культуры разными количествами стандарта токсина и строят кривую зависимости размера зоны задержки роста культуры от количества внесенного микотоксина. По размеру зоны задержки зоны роста тест культуры ис следуемым экстрактом корма определяют . количество микотоксина патулина в пробе.
Чувствительность данного способа к патулину колеблется в прецелах от 1,7 до 2,2 мкг токсина, нанесенного на антибиотический диск. 55
Точность определения микотоксина патулина данным способом сравнима с цругими хроматографическими и спектро» графическими способами определения.
Коэффициент корреляции при сравнении этих способов 0,996% 1) .
Однако данный способ не может быть использован как специфический дпя определения патулина при наличии других. антибиотических веществ потому, что применяемый при определении штамм Вас Иов и е сАегяп МК Ю 1368, как и все другие микроорганизмы, чувствителен в равной степени и к другим анти» биотикам и веществам, обладающим антибакте риапьными свойствами.
Бель изобретения - повышение точности определения количества биологически с активного патулина в пробе корма, исключение биологического действия других антибиотических веществ, наличие которых возможно в экстракте, и достижение высокой чувствительности при опрецелении.
Бель достигается тем, что согласно способу определения в нормах мякоток-: сина патулина,. включавшему экстракдию образца корма гексаном и этилацетатом, пропитку полученным экстрактом антибиотическис дисков и их наложение на заселенный тесч микроорганизмом агар, в качестве тест-микроорганизма используется штамм Ecbev Кроме того, цпя дифференциации пату лина от других антибиотических веществ дополнительно провоцят хроматографию экстракта и наложение хроматограмм на агар, засеянный указанным тест-микроорганизмом Ech8ricb(a С05 тй4 ° Способ осуществляют следующим образом, Пробу корма двукратно экстрагируют гексаном с послецуюшим трехкратным экстрагированием этилацетатом. Этилацетатный экстракт фильтруют через безводный сульфат натрия и упаривают цо получения 1-5 мл и наносят его на стерильные антибиотические диски. Диски с определенным количеством нанесенного экстракта расклацывают на засеянный МПА. Для получения инокулированно б го агара его расплавляют, цовоцят до 50 С и вносят взвесь от оцносуточной культуры EcbBI 1rbia соО М4 (1х10 микробных тел в 1 мл взвеси) иэ расче та 1 мп иа 100 мл МПА. МПА с культурой разливают н& горизонтально рас» положенные бактериопогическйе чашки в количестве по 10 мл в 1, Диски на среду расклацывают равномерно от края чашки и других дисков. 6315 3 103 Чашки с разложенными дисками вы-. держивают 16-18 ч при 37 С. Затем учитывают характер роста Е-cod М4- и сравнивают зоны задержки роста культуры исследуемым экстрактом с зонами 5 задержек роста чистым HpelI& pBToM пату» лина. Патулин наносится на диски. в количестве 0,7, 1,5 и 10 мкг в виде 0,1% раствора в этилацетате. При обнаружении задержек роста куль 10 -туры исследуемым экстрактом его нано сят в двукратном количестве (начиная с минимального количества, дающего зону угнетения роста культуры) на хромотографическую пластинку Силуфол UV -254 15; и разгоняют в системе Б-У (бенэолуксусная кислота 1:3), высушивают, раз резают вдоль хода экстракта пополам О и обэ половины пластин кладут силикагелем вниз на поверхность инокулиро» ванного МПА. Аналогично выдерживают при 37 С. В случае, если вдоль внутренней стора ны хроматограммы обнаружена лишь одна зона задержки роста тест»культуры, Rf 25 которой равен стандарту патулина, расчет количества патулина в пробе производят по размеру зон задержки роста исследуемым экстрактом, нанесенным на диски, по формуле Х Ахв (1) БхГ где А - наименьшее количество патулина, которое вызывает образование задержки роста культуры; В объем экстракта пробы, Б - вес испытуемой пробы корма; Г наименьшее количество экстра)м та, которое подавляет рост тест»культуры, 40 0л» большей то яости определения количества патулина в испытуемом образце можно строить график зависимости размера зон подавления роста культу«45 ры Echer cbio со М4. от количе« ства нанесенного на диск чистого препа- рата патулина, с помощью которого определяют количество патулина- в экстракте, нанесенном на антибиотичес- 50 кий диск. а Если при биоавтографическом проявлении хроматограмм; исследуемого экстракта вдоль внутренней стороны обнаруживается две или более зоны задержки роста культуры, количество патулина определяют по той же формуле, но при этом учитывают количество экстракта, нанесенное на хроматограмму АхВ Б Г БxГ где А - наименьшее количество патулина, нанесенное на хроматограмму, которое вызывает образование зоны задержки роста культуры биоавтографическом проявлении хроматограммы; В - объем экстракта пробы, Б - вес испытуемой пробы корма; Г» наименьшее количество экстрак та, нанесенное на хроматограм му, которое вызывает образование зон задержки культуры при биоавтографическом проявлении хр омат ограммы. Аналогично «оличэство патулина мож но определять цо графику зависимости зон подавления роста культуры Eche v cbia cog Идиот количества нанесенного . на хроматограмму стандарта патулина, Пример . 50 г сухого измельченного корма экстрагируют цвукратно: 1 раз в 100 мл гексана в течение 1 ч, вторично в течение 10 мин 50 мл гексана. Затем пробу высушивают и экстрагиру ют 200 мл этилацетата в течение 1 ч с повторным двукратным экстрагирова» нием по 15 мин с 100 мл этилацетата, Этилацетатные экстракты сливают в одну колбу и выпаривают (лучше под ваку умом при температуре go 45 C) до обье ма 2 мл и наносят в количестве от 1 до 40 мкл на антибиотические диски. В качестве контроля на диски наносят 0,7, 1, 5 и 10.мкг патулина в виде О,f% раствора в этилацетате. Биски равномер но раскладывают на бактериальные чашки с засеянным:. МПА (10 мл МПА на 1 чашку содержащего 0,2 мл взвеси су точной культуры ЕСЬЕг сИ о СОИ М4, 1 х 10 микробных тел в 1 мл взвеси), .Чашки с дисками выдерживают в тече ние 16»18 ч в термостате при 37 С, после чего учитывают характер роста культуры. При учете размеров зон за деркки роста, например, обнаружено по давление роста культуры дисками, со» держащими 20 мкл экстракта и вьппе. Исходя из этого, на хроматографическую пластинку нанооят экстракт в количе стве от 40 до 80 мкл и стандарт па » лина от 1,4 до 10 мкл. Плаетину выоу шивают и разгоняют в системе Б-У. После раэгонки пластинки снова выл. 5 10363 шивают, разрезают по оси, раскладывают силикагелем вниз на аналогично инокулированный МПА и выдерживают в том же температурном режиме. В случае обнаружения на пластинах лишь оцной зоны задержки роста «ульту » ра с К Е, равным патулину, делают рас чет патулина в образце корма по разме рам зон задержки роста культуры иссле . дуемым экстрактом на циске путем по» !О строения калибровочного графика или же по формуле (1) Х О, (мкг к 2000 мкл 14мкг/г 50 г х 20 мкл В случае, если обнаружено цве зоны задержки роста вдоль внутренней стороны разрезанной хроматограммы, проводят расчет количества патулина в пробе, применяя цля этого размеры зон угнете ния роста культуры экстрактом, нанесенным на хроматографические пластинки, путем построения графика или по форму» ле (2) 1,4 мкг х 2000 мкл 50 60 9,33 мкг/r. 50 r x 60 мкл 15 Ь Способ определения патулина прост в исполнении и экономичен, позволяет определять биологически активный патулин в количествах 0,7 мкг в грамме корма и выше. Чувствительность способа может быть повышена путем увеличении навески исследуемого образца для экстрагирования, а также увеличением количества экстракта, наносимого на антибиотичео» кий диск. Теоретически предельная чувствительность способа 0,7 мкг на навеску исследуемого образца, что исхоцит из чувствительности ЕСЬОг(сто cot< М14 -. к 0,7 мкг/циск и выше. Для исполнения способа определения патулина в кормах цля животных не требуется дорогостоящих и цефицит ных реактивов и питательных срец, исходя из чего .он вполне выполним в любой мико- или химикотоксикологической лабораториях. Применение изобретения в практике ветеринарных лабораторий позволяет своевременно профилактировать патулинотоксикозы сельскохозяйственных жи вот» ных, .а также их диагностику на начальной стадии отравления животных. Составитель С. Сютлышев Редактор О. Черниченко Техред A. Бабинец Корректор А. Повх Заказ 5875/3 тираж 5Â7 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4
