Способ получения ингибитора полимеризации фибрина

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ПОЛИМЕРИЗАЦИИ ФИБРИНА путем диализа сырьевого продукта с последующей хроматографической очисткой целевого продукта, ..отличающийс я тем, что, с целью ускорения спо-. соба, в качестве сырьевого, продукта используют сыворотку крови, полученный дисшйзат концентрируют выпариванием , а очистку диализата проводят хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе А 25 в гргщиенте 0,05-0,15 Маи1 монийноацетатного буфера с рН 7,4-7,6. (Л

„„SU„„1044274 А

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

1(5П A 61 В 10/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСЙОМЪ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Ф" \

МФ

° °

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬПЪЙ (21} 3302059/28-13 (22) 12.06. 81 (46) 30..09 ° 83. Бюл. Р 36 . (72) A.Ø.ÁIåâñêèé и Е,А.×èðÿòúåâ . (71) Тюменский государственный медицинский институт (53) 612.115,1(088 ° 8)„ (56) 1. Белицер В.A. Варецкая В.А.

Цинкаловская С.Н., Позднякова Т.М., Орловская Н.М. Изучение некаторых особенностей высокомолекулярных продуктов триптического гидролиза фибриногена = Укр.биохим.и., 1970, т. 42 С. 165-173 °

2, Белицер В.A. Варецкая T.В

Циикаловская С.Н., Позднякова T.È., Толстых В.М. Выделение и исследование высокомолекулярного триптического фрагмента. фибриногена. Укр. биохим, а., 1972, т. 44 с. 411-417 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА

ПОЛИМЕРИЗАЦИИ фИБРИНА путем диалнза сырьевого продукта с последукщей хроматографической очисткой целевого продукта, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью ускорения спо-. соба, в качестве сырьевого. продукта используют сыворотку крови, полученный диалиэат концентрируют выпариванием, а очистку диализата.проводят хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе A

25 в градиенте .0,05-0,15. М аммонийноацетатного буфера с рй 7,4-7,6.

1044274

Составитель С.Малютина

Редактор Т.Портная Техред С.Мигунова Корректор T,Ìèòðîâè÷

Заказ 7398/3 Тираж 713 .

ВНИИПИ Государственного комитеТа СССР по делам изобретений и открытий.

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Подп ис ное

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Изобретение относится к области медицины, а именно биохимии.

Известен способ получения ингибитора полимеризации фибрина путем получения фибриногена иэ бычьей плавны высаливанием сульфатом натрия, рас- 5 щеплением его трипсином, гель- фильт- рации на колонке с сефадексом J-150, выявлением фракций с ингибиторной активностью и лиофилизацией(1).

Однако известный спбсоб не позволяет получить целевой продукт с высокой чистотой.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения ингибитора полимериэации фибрина путем диалиэа сырьевого продукта с последующей хроматографической очисткой(2).

Однако известный способ длите-, лен, так как на подготовительные операции и .освобождение от солей затрачивается более 5 сут.

Цель изобретения — ускорение спо- соба.

Поставленная цель достигается тем, что при осуществлении способа получения ингибитора полимеризации фибрина путем диалиэа сырьевого продукта с последующей хроматографической очисткой целевого продукта,в каЧестве сырьевого продукта используют сыворотку крови, полученный диали- -З0 зат концентрируют выпариванием, а очистку диалиэата проводят хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе А 25 в градиенте 0,05-0,15 М амконийноацетатного буфера срН 7,4-7,6. 35

Пример. 1 л стабилизированной цитратом! натрия (.3, 83; 9 i 1). плазви крови нагревают на водяной бане (56 С) в течение 15 .мин, затем освобождаются от выпавшего фибри- 40 на центрифугированием (1250 g, 15 мин) °

Освобожденную от фибриногена жидкость (сыворотку) диализуют через целлофан против дистиллированной во- 45 ды (1:2), сменяя воду через каждые

4 ч (всего пять. раз). Порции диализата объединяют, Объединенные порции диалиэата (примерно 10 л) упаривают H+ кипя щей водяной бане до объема 50 мл.

В сконцентрированный диализат вносят 180-200 мл геля ДЭАЭ-сефадекса А 25, предварительно -набухшего, в 0,05М аммонийно«ацетатном буфере с рН 7,"4-7,6, и перемешивают при комнатной температуре в течение

0,5 ч, Вышеуказанной смесью заполняют стеклянную колонку (15x500 мм), позволяя жидкости свободно стекать через нижнее отверстие колонки — формируется столбик геля.

Через колонку пропускают 300 мл

0,05 М амм@нийно-ацетатного буфера с pg 7,4-7,6, затем 300 мл 0,10 М . аммонийно-ацетатного буфера с теми же значениями рН и 800 мл 0,15 M аммонийно-ацетатного буфера с теми же значениями рН. Скорость протока

60-70 мп/ч.

При проьивании колонки третьим буферным раствором элюат собирают порциями по 10 мл и в каждой из них определяют наличие ингибитора полимеризации известным методом.

Порции элюата, содержащие ингибитор полимеризации, объединяют и удаляют летучий буфер выпариванием на выпарительных чашках (кипящая водяная баня) до полного удаления раствора.

Сухой остаток на чашках раство-. ряют в 10 мл дистилированной воды и центрифугированием (8000 gg15 мин) освобождаются от нерастворившихся частиц, Надосадочная жидкость содержит ингибитор полимеризации фибрина (целевой продукт).

При многократном применении способа выход ингибитора составляет

28000 усл.ед.,из- 1 л плазмы, что сос тавляет примерно 100% от его содер жания в исходном материале. Полу-, чаеьмй предлагаемым способом ингибитор полимеризации по данным хроматографии на бумаге в системе бутанол — ледяная уксусная кислота— вода 4:1 ° 51двукратное пропускание) и Ю1!Г (двукратное пропускание) содержит в качестве примеси следовые количества серина и аспарагиновой кислоты.

Известный способ позволяет полу чать гетерогенный по данным электрофореэа ингибитор, содержащий значительную примесь фосфатов и хлорида натрия. .. Предложенный способ позволяет сократить число операций и.времени, необходимого ддя пблуЧениЯ ингибнтора полимеризации фибрина в четыре раза (80,5 ч предложенный, 350 ч известный).