Способ определения активности @ -лизин- @ -оксидазы

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ Ц-ЛИЗИН-о -ОКСИДАЗЫ в культуре гриба рода Trichoderma, включающий культивирование гриба на пшеничных .отрубях, центрифугирование водного экстрата культуры и определение активн ости в реакционной смеси, содержащей Ц-лиэин, водный экстракт культуры и буферную смесь с рН 8,0, о т л и , ю щ и и с я тем, что, с целью ускорения и удешевления способа , определение активности фермента проводят по 0,04%-ной перекиси водорода, в состав реакционной смеси вводят о,04%-нуюпероксидазу, 0,5%-ный 0-дианизидгидрохлорид и 0,05м трис-НС1 в качестве буферной системы, а Ц-лизин используют в концентрации 5 мкМ при следующем соотношении компонентов, об.% 0,05М Трис-НС 15-30 в 5 мкМ L-лизин 50-55 0,04%-ная перок идаза4-5 0,5%-НЫЙ О -дианизидингидрохлорид4-5 Водный экстракт культуры12-20 ;О СП

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

У5П С 12 1/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬПЪЮ (21 ) 3376224/28-13 (22) 06.01.82 (46) 15.10.83. Бюл. 9 38 (72) Т.Т.Березов,. С.П.Сяткин и И.П.Смирнова (71) Университет. дружбы народов им. Патриса Лумумбы .(53) 577.15(088.8)

1 (56) 1. Сяткин С.П.,Галаев Ю.В. Окисление путресцина, спермидина и спермина диаминооксидазой печени мыи.—

"Биохимия", 1977, т. 42, вып.б, с. 1010-1013.

2. Kusakabe Н., Kodoma К., Kuninoka А.,Joshino Н., Soda К.

Ext racellulor production Ь- lysin-А-охудаье in the vheot bron cultured а strain of Trichoderma viride.u

"Agricultural Biologic el Chemistry

1980, v. 44, Р 2, р. 387392. (54) (57 ) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТНВНОСТИ (,-ЛИЗИН-cL-ОКСИДАЗЫ в культуре гриба рода Trichoderma, включающий культивирование гриба на пшеничных

„„Я0„„1047957 А,отрубях, центрифугирование водного экстрата культуры и определение активности в реакционной смеси, содержащей (,-лизин, водный экстракт культуры и буферную смесь с рН 8,0, о т л и ча ю шийся тем, что, с целью ускорения и удешевления способа, определение активности фермента проводят по 0,04%-ной перекиси водорода, в состав реакционной смеси вводят 0,04%-ную пероксидаэу, 0,5Ъ-ный 0-дианиэидгидрохлорид и

0,05М трис -HC1 в качестве буферной системы, а L, †.ëèçèí используют в концентрацйи 5 мкИ при следующем соотношении компонентов, об.%

0,05И трис-НС1 15-30

Ф

5 мкй L -лизин 50-55

0,04%-ная перок4 идаэа 4-5

0,5%-ный 0 -дианиэидингидрохлорид 4-5

Водный экстракт культуры 12-20

1047957

Изобретение относится к бЪрхимии, конкретнее к биохимическим способам определения активности ферментов, в частности I„ -лизин-d;-оксидазы и может быть применено в мигробиологии, биохимии, медицине, ферментной 5 медицинской промышленности, для определения активности I.-лизин-d.-оксидазы, которая ингибирует рост лейкемических клеток мыши in vitro u

in vivo. 10

Известен спектрофотометрический способ определения активности другой оксидазы - диаминооксидаэы. Способ основан на взаимодействии образующейся при ферментативной реакции Н О2 15 с 0 -дианизидингидрохлоридом в присуствии пероксидазы. Способ был использован для определения активности диаминооксидаэы в тканях животных, (1 3.

Недостатком способа. является необ-20 ходимость 20-минутной прединкубации проб для определения активности.

Кроме того, способ применяется только для определения активности диаминооксидаэы в экстрактах тканях животных, Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ определения активности L-лизин-с -оксидазы в культуре гриба рода Trichoderma,âêëþ÷àþùèé культивирование гриба на пшеничных отрубях, центрифугирование водного экстракта культуры и определение активности в реакционной смеси, содержащие Ь-лизин, водный экстракт культуры и буферную смесь с рН 8,0.

Определение проводят следующим образом. Реакционная смесь содер- 40 жит L,-лизин и Фосфоркислый калий (рН 8,0 ) в конечных концентрациях соответственно 10 и 70 мкМ, а также

350 ед. каталаэы из печени быка и разные количества водного экстракта культуры гриба. Смесь инкубируют аэробно при 37 С 20 мин со встряхиванием. Реакция заканчивается добавлением 0,1 мл 25Ъ-ного ТХУ и проба центрифугируется. После центрифугирования 1 мл чистого супернатанта смешивается с 2 мп 1 М ацетатного буФера рН 5,0 и 0,8 мл 0,1Ъ-ного

3-метил-2-бенэотиазолинонгидроэон-гидрохлоридом свещеприготовленным.

Инкубация проведена при 50 С 30 мин.

Затем реакционная смесь охлаждается до комнатной температуры, поглощение измеряется против контроля при максимуме поглощения (316-325 нм) на спектрофотометре. белок определя- 60 ют по Лоури и эа одну единицу активности фермента принято количество фермента, каталиэирующего образование 1 мкМ ot.-кето- -аминокапроновой кислоты за 1 мин. (2 ).,, 65

Недостатком известного способа является использование редких и дорогостоящих реактивов: каталазы из бычьей йечени, с -кето-f-àìèíoêàïðîíoвой кислоты, 3-метил-2-бенэотиаэолинон-гидраэонгидрохлорида, а также многостадийность определения.

Цель изобретения — ускорение и удешевление способа определения активности .-лизин-d-,oêñèäàýû.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определе ния активности I„-лиэий-с&оксидаэы в культуре гриба, рода Trichoderma, включающему культивирование гриба на пшеничных отрубях, центрифугирование водного экстракта культуры и определение активности в реакционной смеси, содержащей 4 -лизин, водный экстракт культуры и буферную смесь с рН 8,0, определение активности фермента проводят по 0 04Ъ-ной перекиси водорода, в состав реакционной смеси вводят 0,04Ъ-ную пероксидаэу.

0,5Ъ-ный О-дианиэидгидрохлорид и

0,05М трис-НС1!в качестве буферной системы, а t„ --лизин используют в концентрации 5мкМ при следующем соотношении компонентов, об.Ъ:, 0,05М тРис -НС1 15-30

5 мкМ I. -лизин 50-55

О, 04 Ъ-ная . пероксидаза 4-5

0,5Ъ-ный О-дианизидингидрохлорид 4-5

Водный экстракт культуры 12-20

Способ заключается в том, что фермент L, -лизин-g-оксидазу получают путем культивирования штамма Trichodermа ар.в 250 мл колбе с 10 г пшеничных отрубей 11,4Ъ-ного

NaИО, 1.0 мл Н О при 28 С 14 дней.

Затем в колбу добавляют 100 ил Н20, в течение 2 ч культуру встряхивают ла Яс1;Ixt telaDDarat tyI.e 327 (Premd

ПНР. „ и отжимают через хлопчато бумажную ткань, а водный экстракт центрифугируют от спор и мицелия и определяют активность L-лизин- 4-оксидаэы..

Реакционная смесь содержит,об.Ъ на 1 мл:

О, 05М трис-HCl 15-30

5мкМ I„--лизин 50-55

0,04Ъ--ная пероксидаэа 4-5

О, 5Ъ-ный О -дианиэидингидрохлорид 4-5

Водный экстракт культуры 12-20

Смесь инкубируют аэробно при о.

37 С 20 мин и охлаждают. Реакцию эаканчивают добавлением 1 мл 9„8 н.

НС1 и последующим охлаждением пробы до комнатной температуры.

Оптическую плотность окрашенных растворов измеряют на спектрофотометре при 540 нм.

1047957 Нижняя граница чувствительности метода + 0,1 нмоль, воспроизводи-. мость g 00,1 нмоль.,Пример 1. Инкубационная 10 смесь имеет следующий состав,%:

5мкМ L -лизин 55 ф, 05М трис -НС1 бу,фер, рН 8,0, 15 0,04%-ная перокси- даза 5; 0,5%-ный О -дйаниэидингидрохлорид 5; водный экстракт 20

Смесь инкубировали аэробно при 37 С

20 минут и охлаждали . Реакцию заканчивают добавлением 1 мл 9,8 н.

НС1 и последующим охлаждением пробы до комнатной температуры. Оптическую плотность окрашенного раствора

)(} измеряют спек грофотометрически при 540 нм. Активность фермента в ообе 2, 3 ед. (11, 5 ед/мл экстракта) .

Составитель, В.Муронец

Техред В.Далекорей Корректор В,I èðíÿê

Редактор Т.Веселова

Заказ 7864/28 Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филйал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4

Белок определяют по Лоури. За

1 ед. активности фермента принято .количество фермента, каталиэирую-! щего образование 1 нмоль Н20 за

1 мин в стандартных условиях.

П р е р 2. Инкубационная смесь имеет следующий состав,%:

5мкМ .-лизин 50,трио -буфер, рН 8,0, 30; 0,04%-ная.пероксндаза 4; 0,5%-ный О -дианизингидрохлорид 4, водный экстракт 12. Смесь инкубируют аэробно при 37 С 20 мин и охлаждают. Реакцию заканчивают добавлением 1 мл 9,8 н. НС1 и последукщим охлаждением пробы до комнатной температуры. Оптическую плотность окрашенного раствора измеряют спектрофотометрически при 540 нм. Активность фермента в пробе 1,3 ед. (11,67 ед/мл экстракта ).

Предложенный способ исключает использование дорогостоящих реактивов (каталазы из печени быка и 3;метил-2-бензотиазолинон- гидраэонгидрохлорида, кроме того, существенно сокра- щает определение активности .-лизин-QL-оксидазы (на 30 мин ) за счет отсутствия второй стадии — реакции с

3-метил-2-бенэотиазолинон-гидразонгидрохлоридом.