Способ определения активности моноаминоксидазы в тромбоцитах

 

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ МОНОАМИНОКСИДАЗЫ В ТРОМБОЦИТАХ путем инкубирования исследуемого фермента с субстратом в присутствии индикатора , с последующим измерением его флуоресценции, отличающийся тем, что, с целью пов лие-г ния чувствительности способа при диф ференциальной диагностике психопатологических состояний, вьщеляют митохондрис )льные мембраны тромбоцитов, далее добавляют -210 М пероксидаэы и инкубацию проводят при 36 в течение 15-20 мин, затем в реакционную смесь одновременно вносят субстрат моноаминоксидазы и скополитин . повторно инкубируют, при S 36 - в течение20 - 50. мин и (П измеряют величину флуоресценции скополитина до и после инкубации. 2. Способ по п. 1, отли ч а ющ и и с я тем, что, в качестве субс стратов моносиъшноксидазы используют фенилэтилсшин, бензиламин или триптамин . 4 СО 00

CQOh СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (Н) З(51) G 01 N 33. 48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21),3458314/28-13 (22) 28.06.82 (46) 23.10.83. Бюл. Ю 39 (72) Е.Г.Bpycosa

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ . СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (71) Всесоюзный ордена Трудового

Красного Знамени научно-исследовательский институт общей и судебной ,психиатрии им. В.П.Сербского .(53) 616. 89(088.8) (56) 1. Веревкина И.В., Курилова И.И.

Спектрофотометрический способ опре-. деления активности моноаминоксидазы в тромбоцитах человека, Вопросы медицинской хкмик . 1978, (Ф 1, с. 137-140.

2. Zaitsuk K., Nagai Н., Ohtsubo К., Eto S., Kohoshi K., Ohkura Y ..A Бепв1й1че Fluokometlc аввау of

Нщаап Platelet Monoamine Охране

and Its application on to Assessment

of Monoamine Oxidase Ynh1b1tor.—

СЬев. Plarm. Bull, 26 (11), 3471 34Я6, 1978. (54) (57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВ- .

НОСТИ МОНОАМИНОКСИДАЗЫ В ТРОМБОЦИТАХ путем инкубирования исследуемого фермента с субстратом в присутствии индикатора с последующим измерением

его флуоресценции, о т л и ч а ющ н и с я тем что, с целью повышения чувствительности способа при.дифференциальной диагностике психопатологических состояний, выделяют митохондриальные мембраны тромбоцитов, далее добавляют 1 ° 10 -2 ° 10 М перокси" дазы и инкубацию проводят при 3638 С в течение 155«20 мин, затем в реакционную смесь одновременно вносят субстрат моноаминоксндазы и скополитин повторно инкубируют. при

36 - 38 С в течение 20 - 50 мин и измеряют величкну флуоресценцки скополитина до и после инкубации..

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю" шийся тем, что, s качестве субстратов моноаминоксндазы используют фенилэтиламин, бензиламнн или триптамин.

1049810

Изобретение относится к медицине, н частности к ферментному анализу крови человека, и может быть использовано в медицинской практике при изучении биохимических показателей крови в клинике и эксперименте.

Известен способ определения активности моноаминоксидазы н тромбоцитах человека, основанный на способности алкогольдегидрогеназы из тканей млекопитающих катализиронать восстановление альдегидон, образующихся при окислительном деэаминировании аминов до соответствующих спир. тов в присутствии НАДН (1).

Недостатком способа является его 15 низкая чувствительность.

Известен также способ определения активности моноаминоксидазы путем инкубирования исследуемого фермента с субстратом, .добанлением индикатора 20 с последующим измерением его Флуорес ценции (2).

Однако известный способ имеет низкую информативную ценность, так как н качестве субстрата можно использовать только . бензиламин, н то время как по современным предстанле1 ниям необходимО исследовать актиa"ность моноаминоксидазы с несколькими субстратами, особенно в условиях патологии. Кроме того, 1,2-диаминонаф3 тален, используемый н качестве инди" катора в известном способе, является сильно действующим канцерогенным веществом.

Целью изобретения является повыше- ние чунстнительности способа при диф" ференциальной диагностике психопатологических состояний.

Постанленная цель достигается тем, что согласно способу определения ак- 40 тивности моноаминоксидазы н тромбоцитах путем инкубиронания исследуемого фермента с субстратом в присутствии индикатора с последующим измерением его Флуоресценции, выделяют 45 митохондриальные мембраны тромбоцитов„ далее добавляют 1 10 -2 ° 10 М пероасидазы и инкубацию проводят при

36-38 С н течение 15 " 20 мин, затем

О в реакционную смесь одновременно вно. g0 сят субстрат моноаминоксидазы и скополитин повторно инкубируют при

36 - 38 С в течение 20 — 50 мин и измеряют величину флуоресценции скопо" литина до и после инкубации.

Кроме того, н качестве субстратов моноаминоксидазы используют фенил" этиламин бензиламин или триптамин.

Способ осуществляют следующим об разом. 60

Иэ крови испытуемого выделяют тромбоциты, из которых получают митохондриальные мембраны. Реакционную смесь, содержащую исследуемые фрагменты митохондриальных мембран (0,0), 65

0,2 мы белка), пероксидаэу из хрена (1 10 7-2. 10 M), калий-натрий фосфат- . ный буфер О, 2 М с рН 8,4 до конечно" го объема 1 мл, инкубируют в течение

15 — 20 мин при 36 — 38oC с качанием в аппарате Варбурга для удаления эндогенных субстратон пероксидаэы. После охлаждения проб для определения активности моноаминоксидазы к реакционной смеси одновременно добавляют субстрат фермента: фенилэтиламин, бенэиламин или триптамин, в насыщающих концентрациях и.скополитин с последующим измерением величины флуо. ресценции скополитина. Далее пробы инкубируют н течение 20 — 50 мин при 36 — 38 С. Реакцию останавливают о помещением проб н ледяную баню и определяют величину тушения флуоресценции скополитина.

Удельную активность моноаминоксидазы выражают н нмоль Н О, образонаншейся в ходе окислительного деза" минирования аминов на 1 мг белка за

20 — 50 мин повторного инкубирования н описанных услониях.

Пример 1. Суспенэию фрагментон митохондриальных мембран тромбоцитон 0,01 мг н объеме 0,5 мл натрий" калий фосфатного буфера рН 8,4 noMe" шают н 0,35 мл этого же буфера, со" держащего 10 М пероксидазы иэ хрена и инкубируют 15 мин при 36 С с качаниями н аппарате Варбурга. После охлаждения н ледяной бане в реакцион-.. ную.смесь одновременно добавляют .скополитин н концентрации 17 нмоль на

1 мл и бенэила3лин 2,5-10 М, после чего пробы инкубируют 50 мин при 36 С в аппарате Варбурга. После охлаждения проб измеряют величину тушения

Флуоресценции скополитина при длине волны 460 нм, при длине волны возбуждения 350 нм и наблюдают генерацию

32 нмоль Н О на 1 мг белка, Пример 2. Реакционную смесь, содержащую фрагменты митохондриальных мембран тромбоцитсн 0,05 мг в объеме 0,5 мл натрий-калий фосфатного буфера рН 8,4, пероксидазы 2 ° 10 М в 0Ä35 мл этого же буфера, инкубируют 20 мин при 38 С н аппарате Варбуро га. После охлаждения реакционной смеси и нее одновременно добавляют скополитин в концентрации 1.7 нмоль на

1 мл пробы и фенилэтиламин 104М, после чего пробы повторно инкубируют н течение 20 мин при 38 С, охлаждают, измеряют величину тушения флуоресценции скополитина и наблюдают генерацию

13,1 нмоль Н10 на 1 мг белка.

Пример 3. Суспензию фрагментов митохондриальных мембран тромбоцитон 0,02 мг н объеме 0,5 мл натрийкалий Фосфатного буфера рН 8,4 помещают в 0,35 мл этого же буфера, содержащего 2 10 М пероксидаэы, инку. 1049610

Составитель Е. ситникова

Редактор Н.Бобкова Техред Т,Иаточка Корректор А, Зимокосов

Заказ 8407/41 Тираж 873 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета. СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 .

Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная, 4 бируют 15 мин при 37 С. Далее в ох,лажденную реакционную смесь добавляют скополити 17 нмоль на .1 мл и триптамин 10 М и измеряют величину флуоресценции скополитина. Затем реакционную смесь повторно инкубируют, — 5

40 мин при 37 С, охлаждают и измеря-. о ют флуоресценцию скополитина и по изменению флуоресценции определяют активность моноаминоксидазы. При этих условиях наблюдают генерацию

27,9 нмоль Н О на 1 кг белка.

Предлагаемый способ нетоксичен, обладает высокой чувствительностью, может быть использован в психиатрии при диагностике различных психических заболеваний и оценке зффективности лечения.