Способ хроматографического определения жирнокислотного состава липидов природных объектов

 

СПОСОБ- ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИРНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА ЛИПИДОВ ПРИРОДНЫХ ОБЪЕКТОВ, включающий обработку исследуемого образца растворителями с различной полярно- , стью, отделение липидсодержащего экстрактаот шрота с последукчцей отгонкой растворителя, обработку липидов метанолом и ацетилхлоридом, о тл и чающий с я тем, что, с целью сокращения времени анал11за, ,исследуемый образец делят на три части, обработке растворителем параллельно подвергают две из них, используя в качестве растворителя при обработке первой части диэтиловый эфир с получением метиловых эфнров жирных кислот суммы связанных и прочносвязанных ЛИПИДОВ, второй части - хлорог форм-метанольную смесь в соотношении 2:1 с получением метиловых эфиров жирных кислот прочносвязанных ЛИПИДОВ, третью часть непосредственно обрабатывают ацетилхлоридом и ме танолом с получением метиловых эфиров жирйых кислот суммарных липидов, шроты, полученные после обработки первых двух частей, также обрабатывают ацетилхлоридом и метанолом, метило- i « , вые эфиры жирных кислот, полученные (Л после обработки каждой части и шротов хроматографируют отдельно, при этом F содержание жирных кислот свободных ЛИПИДОВ определяют по разности содержания жирных кислот, полученных послеS обработки третьей и первой частей, содержание жирных кислот связанных ЛИПИДОВ определяют по разности содержания жирных кислотi полученных :л после обработки первой и второй частей исследуемого образца. ч sl

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

:. (>««A

3(51) G 01 N 31 08

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ()ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ :":,. (Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21 ) 336 3001/28-1 3 (22) 18..12. 81 (46) 15.11. 83. Бюл. М 42 (72) Ю. A.Ñóëòàíoâè÷, A.Ï.Нечаев и Г.Б.Колесник (71) Иосковский ордена Трудового

Красного Знамени технологический институт пищевой промышленности (53) 665(088. 8) (56) .1. Биохимическое исследование мембран. N., "Мир", 1979, с. 242

2. Руководство по методам исследования, технохимическому контролю и учету пройзводства в масложнровой промышленности. Т. 1, кн. 1, Л., 1967, с. 196. (54).(57) СПОСОБ ХРОИАТОГРАФИЧЕСКОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИРНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА

ЛИПИДОВ ПРИРОДНЫХ ОБЪЕКТОВ, включающий обработку исследуемого образца растворителями с различной полярностью, отделение липидсодержащего экстракта от шрота с последующей отгонкой растворителя, обработку липидов метанолом и ацетилхлоридом, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени анализа,,исследуемый образец делят на три части, обработке растворителем параллельно подвергают две из них, используя в качестве растворителя при обработке первой части диэтиловый эфир с получением метиловых.эфиров жирных кислот суммы связанных и прочносвязанных липидов, второй части — хлоро-. форм-метанольную смесь в соотношении 2:1 с получением метиловых эфиров жирных кислот прочносвязанных липидов, третью часть непосредственно обрабатывают ацетнлхлоридом и метанолом с получением метиловых эфиров жирных кислот суммарных липидов, шроты, полученные после обработки первых двух частей, также обрабатывают ацетилхлоридом и метанолом, метило- Я ,вые эфиры жирных кислот, полученные после обработки каждой части и шротов ф/ хроматографируют отдельно, при этом содержание жирных кислот свободных С липидов определяют по разности содержания жирных кислот, полученных после обработки третьей и первой частей, содержание жирных кислот связанных липидов определяют по разности содержания жирных кислот, полученных после обработки первой и второй частей исследуемого образца.

1054777

Недостатком этого способа являются большие затраты времени, реактивов, многостадийность, трудоемкость.

Цель изобретения — сокращение., времени анализа.

65

Изобретение относится к способам количественного определения жирнокислотного состава различных групп липидов с применением методов экст.ракции и газовой хроматографии и мо. жет быть использовано в области исследований липидов природных объектов, Известен способ определения жирнокислотного состава липидов природных объектов, заключающийся в обра- 10 ботке исследуемого материала хлороформ-метанольной смесью, отделении экстракта от шрота, отгонке хлороформа и метанола с последующим хроматографированием метиловых эфиров жир- .15 ных кислот свободных и связанных липидов, полученных после обработки липидов метанолом и ацетилхлоридом.

Исходный образец гомогЬнизируют в

10 объемах метанола или смеси хло- . роформ — метанол (1.:1) при комнатной температуре или при po C.К гомогенизату добавляют метанол или хлороформ, чтобы количество растворителя на один объем исходного материала было не менее 20 объемов хлороформ:метанол = 2г1. Экстракцию повторяют три раза. После этого к объединенным. надосадочным жидкостям добавляют на 1 объем 0,2 объема подкисленного СН СООН 0,1 К раство- З0 ра КС2. При стоянии (10-12 ч) образуется двухфазная система. Верхний слой отбрасывают,,нижний промывают, упаривают и выделенные липиды обрабатывают метанолом и ацетилхлоридом 35 с последующим хроматографирЬванием метиловых эфиров жирных кислот свободных и связанных липидов (1) .

Недостатком этого способа является многостадийность, трудоемкость, низ- 4 кая точность и отсутствие возможности определения жирнокислотного состава различных групп липидов, что особенно необходимо при исследовании липидного комплекса микроорганизмов, в котором связанные

45 и прочносвязанные липиды составляют значительную часть.

Наиболее близким к предложенному по технической сущности и дости- . гаемому результату является спо- 50 соб определения жирнокислотного состава липидов природных объектов, включающий обработку исследуемого образца растворителями с различной .полярйостью, отделение ли- 55 пидсодержащего экстракта от шрота с последующей отгонкой растворителя, обработку липидов метанолом и ацетилхлоридом (2J .

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу хроматографического определения жирнокислотного состава липидов природных объектов, включающему обработку исследуемого образца растворителями с различной полярностью, отделение липидсодержащего экстракта от шрота с последующей отгонкой растворителя обработку липидов метанолом и аце) тилхлоридом, исследуемый обра зец делят на три части, обработке растворителем параллельно подвергают две из низ, используя в качестве растворителя при обработке первой части — диэтиловый эфир с получением метиловых эфиров жирных кислот суммы связанных и прочносвязанных липидов, второй части — хлороформметанольную смесь в соотношении 2:1 с получением метиловых эфиров жир ных кислот прочносвязанных липидов, третью часть непосредственно обрабатывают ацетилхлоридом и метанолом с получением метиловых эфиров жирных кислот суммарных липидов, шроты, полученные после обработки первых двух частей, также обрабатывают ацетилхлоридом и метанолом, метиловые эфиры жирных кислот, полученные после обработки каждой части и шротов, хроматографируют отдельно, при этом содержание жирных кислот свободных липидов определяют по разности содержания жирных кислот, полученных после обработки третьей и первой частей, содержание жирных кислот связанных липидов определяют по разности содержания жирных кислот, полученных после обработки первой и второй частей исследуемого образца.

На чертеже показана схема определения жирнокислотного состава различных групп липидов по предлагаемому способу.

Способ осуществляют следующим образом.

Исследуемый образец делят на 3 части. Для определения жирнокислотного состава суммы связанных и прочносвязанных липидов одну часть образца исходного материала обрабатывают диэтиловым эфиром в соотношении 1: 10 на механической качалке в течение 3 ч с трехкратной заменой растворителя. Параллельно другую часть (200 мг) образца обрабатывают хлороформ-метанольной смесью (2:1). Для экстракции берут десятикратное количество растворителя, экстракцию проводят в три стадии. Продолжительность каждой .стадии 1 ч. Шроты, полученные после обработки 1-й и 2-й части образца, высушивают до постоянного веса.

Р третью часть образца и шроты вводят внутренний стандарт (2,0%-ный

1054777 раствор арахиновой кислоты в хлороформе) и обрабатывают полученные образцы 5 мг ацетилхлорида и 2,5 мл метанола. Жидкую фазу упаривают на песчаной бане при 80+3 С, после чего в каждую пробу вводят 0,1 мл гексана, 1 мкл гексановой вытяжки анализируют на хроматографе. Условия анализа» длина колонки 2 м, диаметр 3 мм, сорбент — хроматон й-AW-DMCS (фракция 0,124-0,160 мм) с 20% диэтиленгликольсукцината. Температура термостата колонок 170 С, температура испарителя 220ОС, ðàñход газа-носителя 40 см /мин, детектор — плазменно-ионизационный (ПИД) . Расход водорода 400 см /мин.

По хроматограмме жирнокислотного состава общих (суммарных) липидов определяют площадь полученных пиков и находят содержание отдельных жирных кислот в 1 r исследуемого образца по формуле (2)  мг, ВНс ОВ где S — площадь пика искомой

» кислоты, мм »

5Внс- площадь пика внутреннего стандарта, мм » навеска внутреннего станВн. с дарта, мг» навеска шрота после обраВ ботки исходного образца диэтиловым эфиром, мг.

По хроматограмме метиловых эфиров жирных кислот прочносвязанных липидов, содержащихся в последнем шроте, рассчитывают содержание жирных кислот прочносвязанных липидов по формуле Вис I5 где q - навеска шрота после сняD тия суммы связанных и свободных липидов, мг;.де б; — площадь пика искомой кислоты, мм »

О„- количество внутреннего стан»8Н.С дарта, мг»

БВн,с — площадь пика внутреннего стандарта, мм » навеска исходного образца, »цо мг.

По хроматограмме метиловых эфиров жирных кислот суммы связанных и прочносвязанных липидов, полученных после анализа шрота первой части образ.ца, определяют содержание жирных кис кислот (В) в связанных и прочносвязанных липидах по формуле

5 D — вес шрота, полученного пос ле обработки 1 г исходного образца.

Содержание жирных кислот в свободных липидах определяется по разности

С; = A; - О;, мг., (4) Содержание жирных кислот в связанных липидах определяется по формуле

E(Вс 0(hler (s) Пример. Объект исследова15 ния — воздушно-сухие хлебопекарные дрожжи, содержащие в основном ли пиды в виде связанных и прочносвязанных групп.

Исходный образец делят на три части. Для определения RHpHQRHcJIDT ного состава суммарных липидов к третьей части (100 мг добавляют

2,0%-ного раствора в хлороформе арахиновой кислоты в качестве внутреннего стандарта и обрабатывают 5 мг ацетилхлорида и 2,5 мл метанола. Жидкую фазу упаривают на песчаной бане при 80+Зо С, после чего в колбочку добавляют 0,1 мл гексана. 1 мкл гексановой вытяжки вводят в хроматограф.

Условия анализа: длина колонки 2 м, диаметр З.мм, сорбент-хроматон

NAW-DMCS (фракция О, 124-0, 160 мм), с 20% диэтиленгликольсукцината. Температура термостата колонок 170 С, температура испарителя 220"С, расход газа-носителя 40 см3/мин. Детектор пламенно-ионизационный (ПИД1. Расход водорода 40 см3/мин, воздуха

400 см»/мин.

40 По хроматограмме жирнокислотного состава суммарных липидов хлебопекарных дрожжей, определив площадь полученных пиков, находят содержание отдельных жирных кислот в 1 r хлебо45 пекарных дрожжей по формуле (1).

Для определения жирнокислотного состава суммы связанных и прочносвя занных липидов первую часть (200 мг) исходного материала обрабатывают диэтиловым эфиром в соотношении

1:10 на механической качалке в течение 3 ч с трехкратной заменой растворителя. Полученный шрот высушивают до постоянного веса и липиды, оставшиеся в шроте, обрабатывают

5 мг ацетилхлорида и 2,5 мл метанола с последующим хроматографированием в указанных условиях. По хроматограмме метиловых эфиров жирных кислот суммы связанных и прочносвя60 занных липидов определяют содержание жирных кислот в связанных и прочносвязанных липидах по формуле (2).

Содержание жирных кислот в свободных липидах определяют по разносу ти (см. формулу 4 )1054777

Содержание жирных кислот, мг на 1 r образца, в литрах

Кислота свободных прочносвяэанных связанных суммарных

3,06

2,25

0,99

6,30

С1ь,1

4,11

C frill

10, 26

1,64

14,96

3,07

17,44

0,34

2,34

0,38

4,25.

4,25

23,72,2,15

0,81

0,51

3,47

С 1Ь. 2

ВНИИПИ Заказ 9096/51

Тираж 873 Подписное

Для определения жирнокислотного состава связанных:и прочносвязанных липидов первую часть исходного образца (200 мг) обрабатывают хлороформ-метанольной смесью (2:1), исходный образец — растворитель в соотношении 1:10, в течение 3 ч с трехкратной заменой растворителя.

Шрот высушивают до постоянного веса, обрабатывают 5 мг ацетилхлорида и

2,5 мл метанола и хроматографируют в указанных условиях.

Использование предлагаемого спо.соба по сравнению с прототипом позволяет уменьшить продолжительность определения жирнокислотного состава .различных групп липидов в 4-8 раз (с 47 ч до 14-5 ч) и повысить точПо хроматограмме метиловых эфиров жирных кислот прочносвязанных липидов, содержащихся в последнем шроте; рассчитывают содержание жирных кислот. прочносвяэанных липидов по формуле (3).

Содержание жирных кислот в связанных липидах определяется по разности (см. формулу 5).

10 Результаты анализов и расчетов сведены в таблицу, ность анализа в 1, 5-3 раза за счет сокращения количества операций (с

30 до 20), что способствует уменьше нию потерь исследуемого образца, и

35 параллельно с этим сократить расход реактивов в 2-7 раз.

Филиал ППП "Патент", r,Ужгород,ул.Проектная,4