Способ получения амфолитаносителя для изоэлектрического фокусирования и изотахофореза

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМФОЛИТАНОСИТЕЛЯ ДЛЯ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ФОКУСИРОВАНИЯ И ИЗОТАХОФОРЕЗА путем модифицирования полиэтиленполиамина непредельным соединением ивзаимодействия модифицированного полиэтиленполиамина с акриловой кислотой , отличающийся тем, что, с целью увеличения эксплуатационных свойств амфолита-носителя, в качестве непредельного соединения используют соединения, содержа .щие активированную электроноакцепторными группами этиленовую связь общей формулы RJ-OH O: X ) где X - rCN ; , -COR-; -CONRR ; ; -PO(OR) ; 2-3- или 4-пиридил; R и R- атом водорода, алкил или ари л; (Л атом водорода, -СН или X, и модифицирование осуществляют в водной среде при 20-70с в течение 1-20 ч при молярном соотношении модификатора и полиэтиленполиамина

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТ ИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„„SU„„10 221 А

3(59 С 08 G 73 G 7/00 аМ »

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ,, К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3437857/23-05 (22) 06.05.82 (46) 23.12.83. Бюл. Р 47 (72) Г.И.Денис, Г.A.Гавенас, К.К.Янулайтене, A.- С.A.Ãëå æà, И.И.Кюдулас.и B.É.Ëàóöþñ (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (53) 661.183.123(088.8) (56). 1, Vinogradov S.N. et а1.

Synthetic атпрЬо0уСез for the isoeEectr1c focusing of proteins.

B1ochem. Biophys. Res.Comm., 1973, v. 54, р. 501.

2. Авторское свитедельство СССР

Р 802310, кл. С 08 G 73/02р 1982 (прототип). (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМФОЛИТАНОСИТЕЛЯ ДЛЯ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ФОКУСИРОВАНИЯ И ИЗОТАХОФОРЕЗА путем модифицирования полиэтиленполиамина непредельным соединением и взаимодействия модифицированного полиэтиленполиамина с акриловой кислотой ., отличающийся тем, что, с целью увеличения эксплуатационных свойств амфолита-носителя, в качестве непредельного соединения используют соединения, содержа,щие активированную электроноакцепторными группами этиленовую связь общей формулы

Гю 2

R — QH--Q

Х где Х вЂ” т-СИ, -СООТГ, -СОВт -СОНИН

-SOq R, «ЗОу NRR -PO (ОВ)у

-NO, 2-3- или 4-пиридил;

R u R - -атом водорода, алкил или арил;

R и R2- атом водорода, -СНя или Х, и модифицирование осуществляют в водной среде при 20-70 С в течение 1-20 ч при молярном соотношении

:модификатора и полиэтиленполиамина (1-3):1.

1062218

Изобретение относится к биохимии, а именно: к способам разделения белковых веществ.

Известны способы синтеза амфолитов-носителей для изоэлектрического фокусирования, в частности способ получения амфолитов-носителей путем взаимодействия акриловой кислоты с полиэтиленполиаминами (ПЭПА), например с триэтилентетрамином, тетраэтиленпентамином. < и пентаэтиленгексамином или их смесями (1) .

Однако такие амфолиты-носители обладают недостаточной разделяющей способностью, малой буферной емкостью и малой проводимостью в нейтральной области рН.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения амфолита-носителя из акриловой кислоты ,и полиэтиленполиаминов, модифицированных Н,И .-метилен-50С -акриламидом f2) .

Однако N,N -метилен-бас -акриламид связывает амины и повышает мо; лекулярную массу амфолита-носителя, что усложняет его отделение от аналичируемых белков. Амфолиты-носители, полученные известным способом, обладают недостаточной буферной емкостью в нейтральной области рН, образуют недостаточно линейный гра" диент рН.

Цель изобретения — улучшение эксплуатационных свойств амфолитаносителя. .Для достижения цели согласно способу получения амфолита-носителя для изоэлектрического фокусирования и изотахофореза путем модифицирования полиэтиленполиамина непредельным соединением и взаимодей,ствия модифицированного полиэтиленполиамина с акриловой кислотой, в качестве непредельного соединения используют соединения, содержащие активированную электроноакцепторными группами этиленовую связь общей формулы.Х где Х вЂ” CN, -C00R, -COR; -CONRR ;

-Яо В", -Яо иВВ "; -x 0 (оВ),;

-NO, 2-3- или 4-пиридил;

В и  — атом водорода, алкил или арил;

В и R>- атом водорода, -СН) или Х, ( и модифицирование осуществляют в водной среде при 20-70 C в течение

1-20 ч при молярном соотношении модификатора и полиэтиленполиамина (1-3):1, В ходе модификации происходит присоединение первичных и вторичных аминогрупп полиэтиленполиаминов к активированной этиленовой связи

65 с образованием смеси веществ формулы

У» N- (QH -QH — Ц+- X

Г (It,

f где Y = Н или -CR H-CR X

n = 1-6.

Модификацию ПЭПА предпочтительно проводить черед их взаимодействием с акриловой кислотой, так как при этом обеспечивается быстрая и полная реакция модификаторов, но возможна модификация в ходе действия и после действия акриловой кислоты.

Разделяющая способность изоэлектрического фокусирования определяется как разность наиболее близких изоэлектрических точек белков, еще разделяемых фокусированием. Согласно теории изоэлектрического фокусирования, два амфотерных электролита (амфолита) с различными изо электрическими точками не могут быть разделены путем изозлектрического фокусирования на отдельные зоны. Для этого необходим третий амфолит, имеющий изоэлектрическую точку в интервале между изоэлектрическими точками разделяемых веществ. Например, для разделения белков с близкими значениями изоэлектрических точек в амфолитеносителе должны быть вещества с про. межуточными значениями изоэлектрических точек. Поэтому для достижения высокой разделяющей способности изоэлектрического фокусирования необходимо, чтобы в составе амфолитаносителя было возможно большее количество компонентов, распределенных во всем рабочем интервале рН.

Это обеспечивает и прямолинейность грациента рН.

Изоэлектрическая точка амфотерного вещества определяется константами диссоциации его кислой и основной групп. Изменение констант диссоциации обуславливает изменение изоэлектрических точек амфотерных электролитов. Сближение констант диссоциации кислотной и основной группы увеличивает буферную емкость и проводимость амфотерного электролита. Это создает возможность снижения концентрации амфолита-носи-теля, уменьшает выделяемое во время анализа тепло, стабилизирует градиенты рН.

Предлагаемый способ получения амфолитов-носителей улучшает их свойства, так как увеличивается число индивидуальных амфотерных сое-, динений в составе амфолита-носителя. Например, при взаимодействии

1 моль триэтилентетрамина с 1 моль акриловой кислоты образуется две амфотерные аминокислоты, содержащие в молекуле по одному Р --карбоксиэтильному остатку и. меньше пяти аминокислот, содержащих по два таких остатка. Таким образом, в амфолите-носителе содержатся в за I метных количествах 7 амфотерных соединений. Если же на 1 моль триэтилентетрамина подействовать

1 моль модификатора (например, акрилонитрила) и 1 моль акриловой кислоты, число образующихся амфотерных производных возрастает до 56, т.е. увеличивается восьмикратно. Если использовать не один модификатор, а несколько, число производных еще многократно увеличится. Таким. образом, предлагаемая модификация дает возможность увеличить на порядок и более число амфотерных компонентов амфолита-носителя. Это улучшает линейность градиента рН и разделяющую способность при изоэлектрическом фокусировании..

Кроме того, при модификации смещаются константы диссоциации аминогрупп. Известно, что присоединение к аминам веществ, содержащих активированную этиленовую связь, изменяет константу диссоциации данного амина. Так, присоединение винилметилсульфона уменьшает кон;станту диссоциации (pKq) на 2,823,13 ед;, присоединение акрилонитрила — на 2,21-2,50, 2-метилакрилонитрила — на 2,37-2,65,, (-дихлорэтилового эфира винил фосфиновой кислоты — на 1,70, винилметилкетона — на 0,40. Предлагаемая модификация понижает значения

РКц аминогрупп и сближает их с KOHстантами диссоциации кислотных групп. Поэтому предлагаемый амфолит носитель приобретает большую бу> ферную емкость и проводимость, по сравнению с известными.

Предлагаемый амфолит-носитель готовят следующим образом.

Пример 1. В трехгорлой колбе емкостью 100 мл с мешалкой, капельной воронкой и приспособлением для продувки азотом помещают 9,0 r .(0,06 моль) триэтилентетрамина и

20 мл деионизированной воды. При . перемешивании по каплям вводят

1,59 г (0,03 моль) акрилонитрила и 4,9 г (0,03 моль) метилового эфира винилфосфоновой кислоты. Смесь перемешивают 2 ч при 70 С, затем охлаждают до комнатной температуры, добавляют по каплям 6,46 г(0,09 моль) свежеперегнанной акриловой кислоты и перемешивают 16 ч, при 70 С. Продукт реакции разбава ляют до 88 мл, трижды обрабатывают активированным углем (в ат/

10622! 8 мосфере азота) при 80-90 С и фильтруют.

Псчученный таким образом амфолит-носитель образует прямолинейный градиент рЧ в интервале

3-9 при изоэлектрическом фокусировании в градиенте плотности. При изоэлектрическом фокусировании в тонком слое сефадекса амфолитноситель образует примерно прямо10 линейный градиент рН в интервале

5,5-8,0. Аналогичные амфолиты-носители, изготовленные по известным методикам, дают нелинейные градиенты рН.

15 Пример 2. В аппаратуру, описанную в примере 1, помещают

9,45 r (0,,4 моль) смеси полиэтиленполиаминов (фракция, кипящая при

100-220 С/1 мм), 30 мл деионизированной воды, 3,3 г (0,025 моль) винилфенил сетона, 2,65 г (0,032 моль винигметилсульфона, 2,15 r (0,025 моль) метилового эфира акрило. вс.й кислоты и 1,75 г (0,035 моль) винилметилкетона. Смесь перемешивают в течение 5 ч при комнатной температуре, затем по каплям до° бавляют 1,2 г акриловой кислоты и перемешивают 20 ч при 70 С. Реакционную смесь разбавляют до 100 мл и обраба ывают как описано в примере 1.

Синтезированный таким путем амфолит-носитель образует прямолинейный градиент рН в интервале 3-8.

35 Пример 3. B аппаратуру, описанную в примере 1, помещают

11,3 r (0,07 моль) смеси полиэт-,:— ленполиаминов (фракция, кипящая при

100-200 С/1 мм) и 20 мл деионизи.—

4() рованной воды. Через капельную воронку вводят смесь 7,0 r (0,04 моль) акрилоилморфолина, 3,44 г (0,04 моль) кротонойитрила, 5,.15 г (0,04 моль) винилсульфонамида и 6,48 r (0,09 моль)

45 акриловой кислоты. Смесь перемешивают при 50 С в течение 18 ч, о разбавляют деионизированной водой до 110 мл и обрабатывают как описано в примере 1.

Синтезированный таким образом амфолит-носитель образует прямолинейный градиент рН в интервале 3-9.

Снижение температуры дистилляции до 200 С исключает образование окрашенных смол, что улучшает качество амфолита-носителя.

Пример 4. (изоэлектрическое фокусирование белков).

С помощью амфолита-носителя, по6() лученного по предлагаемому способу, проводят изоэлектрическое Фокуси рование модельных белков в тонком слое сефадекса и в градиенте плотности. Определяют изоэлектрические 5 точки белков иэозлектрическим фоку-.

10622l8

Изоэлектрическая точка, полученная с использованием предлагаемого амфолит-носителя

Литературные данные

Белок

Среднее значение

Эксперимент

4,3 4,4 4,45 4,45

4,40

4,4

Ферритин

4,66

4,6 4,65 4,7 4,7

4,7

Альбумин

7,2 7,3 7,3 7,35;7,4 7,31

7,3

Миоглобин

Составитель В.Икртычан

Редактор Н.Егорова ТехредИ.Костик, Корректор A.Èëüèí

»«»«» «l »«»«

Эаказ 10154/26 Тираж 494 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 сированием в тонком слое сефадекса с использованием амАолнта-носителя, Изоэлектрические точки белков, полученный с использованием предлагаемого амфолита-носителя, хорошо совпадают с литературными данными.

Разделяющую способность амфолитаносителя определяют изоэлектрическим фокусированием гемоглобина в градиенте плотности. Визуальное сравнение разделенных полос гемоглобина показало, что оно выше, чем в предлагаемом эксперименте с амфолитомносителем„ полученным по известному способу. изготовленного по примеру 2. бранные приведены в таблице.

Преимуществом предлагаемого способа является также упрощение процесса изготовления амфолитов-носителей за счет использования более легкокипящих фракций технической смеси полиэтиленполиаминов при сохранении достаточно хорошей линей" ности градиента рН. Снижение температуры перегонки упрощает этот процесс, кроме того, уменьшается возможность образования побочных окрашенных продуктов, что улучшает качество амфолита-носителя,