Способ выделения белков и нуклеиновых кислот из белково- нуклеиновых смесей

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

<1ц960261 (61) Дополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено 210431 (21) 3277664/28-13 (И) М. Кл.з

С 12 Р 21/00

А 23 7 1/18 с присоединением заявки ¹â€”

Государственный комитет

СССР яо делам изобретений и открмтий (23) Приоритет —. (Щ УДК 668. 392 (088.8) Опубликовано 230982. Бюллетень ¹35

Дата опубликования описания 2309.82 (72) Авторы изобретения

А.М. Мамцис, В.В. Николаева, С.М.Андреев, О.М.

Е.С.Вайнерман и С.В.Рогожин (71) Заявитель

Ордена Ленина. институт элементоорганических с

AH СССР (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

ИЗ БЕЛКОВО-НУКЛЕИНОВЫХ СМЕСЕИ

Изобретение относится к микробиологии и прикладной биохимии и касается разделения белково-нуклеиновых смесей, содержащихся в экстрактах, получаемых из объектов микробиологического происхождения,,и может быть использовано как в лабораторной практике, так и при решении практических задач, связанных с получением очищенных белков и нуклеиновых кислот.

Известен способ отделения белков от нуклеиновых кислот, основанный на термической коагуляции белка в присутствии раствора нейтральной 15 соли. Согласно этому способу раствор, содержащий белок и нуклеиновые кислоты и 3-7% хлористого натрия, нагревают в течение нескольких минут до 80-100 С при рН 6,0-8,5. 20

При этом белок подвергается термокоагуляции и выпадает в осадок, а нуклеиновые кислоты остаются в растворе.

Этот способ разделения белково; нуклеиновых смесей дешев и позволяет получать белок.с низким содержанием нуклеиновых кислот 2% fi), Недостатком этого способа является потеря функциональных свойств белка в результате термокоагуляции, что в свою очередь, сильно затрудняет его дальнейшее использование и переработку. Кроме .того, около

20-30% белка остается в растворе и теряется при выделении нуклеиновых кислот

Известен способ отделения белка от нуклеиновых кислот, основанный на обработке раствора, содержащего белково-.нуклеиновую смесь, нуклеолитическими ферментами с последующим осаждением белка в изоэлектрической точке и выделением из раствора продуктов гидролиза нуклеиновых кислот.

Такой способ позволяет сохранить функциональные свойства белка и понизить содержание в нем нуклеиновых кислот до 2% (2).

К недостаткам такого метода следует отнести. высокую стоимость и труднодоступность !нуклеолитических ферментов (например, стоимость панкреатической рибонуклеазы 66 тыс.руб/кг).

Это обстоятельство делает такой метод дорогим и малопригодным для крупнотоннажного производства белков..

Известен способ разделения белков и нуклеиновых кислот, основанный на

960261 различии в распределении биополиме-. ров в двухфазных системах. Согласно данному способу к 25-80%-ному вод. но-спиртовому раствору белково-нуклеиновой смеси добавляют 1-8% неорганической водо астворимой соли по отношению к исходной смеси. При этом образуется двухфазная система, сос. тоящая из водно-спиртовой фазы, которая содержит .белок, и водно-солевой фазы, в которой концентрируются нуклеиновые кислоты.

Данный метод позволяет получать белок с низким содержанием нуклеиновых кислот (1,8-2,0%), беэ потеои функциональных свойств 3).

К недостаткам данного метода следует отнести сложность аппаратурного оформления процесса, особенно в условиях крупнотоннажного производства

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ выделения белков и нуклеиновых кислот из белково-нуклеиновых смесей путем обработки исходной смеси ангидридом дикарбоновой кислоты, в частности янтарным ангидридом при рН, равном 7,5 и весовом соотношении исходная смесь — янтарный ангидрид

1:1-1 0,4 с последующим осаждением белка из раствора в иэоэлектрической точке.

Известный способ позволяет получать белок с хорошими функциональными свойствами, низким содержанием нуклеиновых кислот (менее 2%) и высоким выходом (90%) 4).

К недостаткам известного способа относятся высокая стоимость янтарного ангидрида (89 руб/кг), что

s свою очередь, приводит к повышению стоимости конечных продуктов, потеря питательной ценности белков, так как в процессе выделения происходит сукцилирование -аминогрупп лизина, содержащегося в белке, которые усваиваются организмом хуже, чем несукционированные из-эа повышенной устойчивости к действию протеолитических ферментов. Укаэанные недостатки- делают известный способ малопригодным для крупнотоннажного производства пищевых белков.

Целью изобретения является удешев ение способа разделения белковонуклеиновых смесей и повышение биологической ценности белка.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения.белков и нуклеиновых кислот иэ белково-нуклеиновых смесей, предусматривакщему обработку их ангидридом кислоты и осаждение белка, в качестве ангидрида кислоты используют полифосфорную кислоту при весовом соотношении белок — полифосфорная кислота 1г0,25-1:0,75.

10

Обработку белково-нуклеиновой смеси полифосфорной кислотой ведут при рН, равном 7,0-9,0, осаждение белка осуществляют при рН 5,0-5,5, а нуклеиновых кислот — при рН 1,0,—

1,5.

Пример 1. 2 г белково-нуклеинового концентрата, полученного из биомассы дрожжей рода Cgndida Mycoderma растворяют в 100 мл 0,05 н раствора NaOH и доводят рН раствора до 9,0, добавляя по каплям б н.

НС1, К полученному раствору прибавляют по каплям при перемешивании

3,0 мл 20%-ного водного раствора 5 полифосфорной кислоты,.поддерживая значение рН 8,0 добавлением 5н.раствора NaOH. Затем раствор перемешивают 30 мин при рН 8,0 и осаждают белок при рН 5,5 добавлением 6 н,НС1. Осадок белка отделяют центрифугирова- . нием, промывают подкисленной водой и сушат лиофильно.. Из надосадочной жидкости при рН 1,5 выделяют осаждением нуклеиновые кислоты, отделяют центрифугированием и сушат.

В итоге получают 1,4 г (90%) с содержанием нуклеиновых кислот

1,6% и растворимостью.при рН 7,0

100% и 0,37 r $80%) нуклеиновых кислот с содержанием основного ве-Зо щества 60%.

Пример 2. 2 г белково-нуклеинового концентрата, полученного из биомассы доожжей рода Condida

utilis,,растворяют в 100 мл 0,05 н.

35 раствора едкого натра и доводят значение рН раствора до 9,0 добавлением б н. НС1, К полученному оаствору прибавляют по каплям при перемешивании 1,5 мл 20%-ного водного

40 раствора полифосфорной кислоты, поддерживая значение рН 7„0 добавлением 5 н. раствора едкого натра. Затем раствор перемешивают 30 мин при рН 7,0, и осаждают белок при

45 рН 5,3 добавлением б н. НС1. Осадок белка отделяют центрифугированием, промывают подкисленной водой и сушат лиофильно. Из надосадочной жидкости осаждают при рН 1,0 нуклеиновые кислоты, отделяют центрифугированием и сушат.

В итоге получают 1,35 r (80%) белка с содержанием общего азота 14,6,% нуклеиновых кислот 2,0% и раствори- . мостью при рН 7,0 95% и 0,40 r (82%) нуклеиновых кислот с содержанием основного вещества 50%, Пример.3. 100 г белковонуклеинового концентрата, полученного иэ биомассы дрожжей рода Saccharo60 myces cerevisiaI и содержащего 75 г белка, растворяют 5,0 л 0,05 н. раствора едкого натра и доводят рН раствора до 9,0 добавлением 6 í. НС1.

К полученному раствору прибавляют по каплям при перемешивании 225 мл 20%960261

Формула изобретения

Составитель М.Ларина

Техред М.Гергель Корректор.E.Ðîøêî

Редактор Л.Лукач

7149/31 Тираж 505 подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изббретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 ного водного раствора полифосфорной кислоты, поддерживая значение рН 9,0 добавлением 5 н. раствора ед кого натра. Затем раствор перемешивают при рН 9,0 в течение 30 мин ,и осаждают белок при рН 5,0 добавлением 6 н. НС1. Осадок белка отде,ляют центрифугированием, промывают подкисленной водой и сушат .лиофильно.

Из надосадочной жидкости при рН 1,5 осаждают нуклеиновые кислоты, отделяют центрифугированием и сушат.

В итоге получают 67,5 r (90%) белка с содержанием общего азота

14,8%, нуклеиновых кислот 1,5% и растворимостью при рН 7,0 100% и 11,0 r. нуклеиновых кислот с содержанием основного:вещества 65%. .Как видно из приведенных примеров, предложенный способ позволяет получать белок с высоким выходом (80-90%) низким содержанием. нуклеиновых кислот (1,5-2,0%) и хорошими функциональными свойствами, в частности, высокой растворимостью в физиологическом интервале рН (5-9), что особенно важно для их последующего использования. Белки, выделяемые согласно предложенному способу, хорошо расщепляются протеолитическимц ферментами и по атакуемости

in vitro ферментами близки яичному, ал.ьбумину.

Кроме того, изобретение позволяет снизить затраты на разделение белково-нуклеиновых смесей за счет замены янтарного ангидрида полифосфорной кислотой.

Способ выделения белков и нуклеи-. новых кислот иэ белково-.нуклеиновых смесей, предусматривающий обработ.ку их ангидридом кислоты и .осаждение белка. отличающийся тем, что,. с целью удешевления процесса и повышения биологической ценности белка, в качестве ангидрида кис лоты используют полифосфорную кис-лоту при весовом соотношении белка и полифосфорной кислоты 1:0,25-1:0,75.

Источники информации, принятые. во внимание при .экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

25 Р 274059. кл. С.12 D 13/06. 1970.

2. Авторское свидетельство СССР

Р 557785, кл. A 23 У 1/18, 1975.

3. Авторское свидетельство СССР

9 754857, кл. С 12 9 .13/06, 1978.

-30 . 4. патент CQIA 9 4168262, кл. 260-112,- опублик. 1979.