Способ получения полипептидов

 

0 Il И C A H H E (и,,980615

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Н ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 08. 12. 78 (23) 2700902/23-04 (5lj М. Кл. (23) Приоритет - (32) 08. 12. 77

С 07 С 103/52

А 61 К 37/02

1осудеретеенный квинтет

СССР по делам нэобретеннй н еткрытий (31) 858496 (33} Сщд

Опубликовано07. 12. 82. Бюллетень ¹ 45 (53} УДК547 964. .4.07(088.8 ) Дата опубликования описания 07. 12.82,72) Автор изобретения

Иностранец

Гидеон Гольдстейн

Иностранная фирма

"Орто фармасьютикал Корпорейшн". (США) <71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ

Изобретение относится к способу получения новых полипептидов — биологическиактивных соединений, которые могут быть применены в медицине.

Известен метод твердофаэного синтеза, который широко используют в химии пептидов. Сущность метода состоит в присоединении С-концевой аминокислоты, синтезируемой пептидной цепик твердому полимеру ковалентной связью и последовательном присоединении остальных аминокислот ступенчато (одна за другой ) пока не будет "собрана" .вся необходимая аминокислотная последовательность (1 ).

Известен также метод, при котором синтезированный пептид .удаляют с полимерной подложки и отщепляют оставшиеся защитные группы. Метод позволяет в процессе синтеза удалять побочные продукты, избыток реагентов фильтрованием и отмывкой. В качестве носителя используют различные нерастворимые полимеры, содержащие в своей структуре- функциональные группы, при2 годные для ковалентного присоединения первой защищенной аминокислоты, такие . .как целлюлоза, поливиниловый спирт, полиметилметакрилат, сульфированный полистирол, хлорметилированный сополимер стирала и дивинилбензола, бензгидриламинная смола и т.п.. Не вступающие в реакцию функциональные группы аминокислот, из которых строится

1р пептидная цепь, блокируют, используя обычно применяемые в пептидной химии защитные группы, например третбутилоксикарбонильная, бенэилоксикарбонильная, бенэильная и т. и.. Деблокироватб ние защитных групп конечной пептидной цепи осуществляют обычно с помощью от.носительно мягкой обработки защищенного пептида кислотой (например, три" фторуксусной ). Использование известер ных методов синтеза позволяет получить полипептид, обладающий своеобразными фармакологическими свойствами (21.

Цель изобретения - получение ново, ro полипептида.

3 980615

Поставленная цель достигается способом получения полипептидов общей формулы

X- Lys — у - Gln — R, (1 ) где Х: Sz„, 1 А1а, ОА1а;

ЕГс СО с

R: Н, СН СО, С Н заключающийся в том, что замещенный по аминогруппе L-глутамин присоединяют к нерастворимой полимерной смоле ковалентной связью предпочтительно в среде абсолютного этанола при +80 G; удаляют с -аминозащитную группу от глутамина обработкой продукта присо- 35 единения аминокислота-полимерная смола трифторуксусной кислотой, деблокированную аминогруппу L-глутамина подвергают. взаимодействию с Y-аминокислотой, защищенной по Ы-аминогруппе, 20 используя предпочтительно карбодиимидный метод, после удаления о -аминозащитной группы обработкой трифторуксусной кислотой, продукт вводят во взаимодействие с L-лизином, защищенным по

d-аминогоуппе,.предпочтительно используя карбодиимидный метод, полученную защищенную no d-аминогруппе трипептидполимерную смолу деблокируют обработкой трифторуксусной кислотой и три- зо пептид-полимерную смолу конденсируют с N- R-замещенной с X-аминокислотой; защищенной по ee d-аминогруппе, предпочтительно используя карбодиимидный метод, обработкой полученного продук- з

t та кислотой, если R-0H, или аммиаком с в диметилформамиде, если R-NH< отщепляют пептидную цепь от смолы и защищенный пептид деблокируют обработкой трифторуксусной кислотой, и в случае 4О использования бензгидриламиновой смолы (R-NH ) независимо от обработки ! продукта кислотой или аммиаком.

Предпочтительным вариантом способа является использование в качестве полимерной смолы хлорметилированного полистиролдивинилбензола и бензгидриламиновой смолы.

Пример 1. При получении полипептида используют о-нитрофенидовый эфир N-третбутилоксикарбонил-L-глутамина, М-третбутилоксикарбонил-N-2е

-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, й-третбутилоксикарбонил-О- бензил-L-серин, N-третбутилоксикарбонил-L-аланин >>

Ы

В этих реагентах третбутилоксикарбонильная группа в дальнейшем будет обозначаться сокращенно как ВОС-груп4 па. Реагенты для определения аминокислотной последовательности марки."Секвенал" ("Sequenal"), а именно: дициклогексилкарбодиимид, флуорескамин и смола для твердофазного синтеза. Смола, использованная для синтеза, представляла собой хлорметилированную полистирол-дивинилбензольную смолу в виде гранул размером 200-400 меш, содержащую 1Ф дивинилбензола и 0,75 ммоль хлора на грамм смолы. Для получения полипептида 2 ммоль с -80С-L-глутамина этерифицируют 2 ммоль хлорметилированной смолы в среде абсолютного спирта, содержащего 1 ммоль триэтиламинг, в

О течение 24 ч при 80 С. Полученную смолу, содержащую остато! ВОС-глутамина, присоединенный к ней сложноэфирной связью, отделяют фильтрованием, промывают абсолютным спиртом и сушат до постоянного веса. Затем аналогичным образом присоединяют другие о -ВОС"аминокислоты„ которые сочетают с деблокированной oL-аминогруппой на конце пептидной цепи, связанной с полимерной подложкой (смолой ), в надлежащей последовательности, используя в качестве конденсирующеro (сочетающего ) реагента эквивалентное количество дициклогексилкарбодиимида. 8 реI зультате этой последовательности реакций был получен полипептид формулы (l), причем после каждой реакции сочетания отбирают аликвоту смолы, которую анализируют с помощью флуорескамина на полноту протекания реакции и, если при этом обнаруживают положительную флуоресценцию, что свидетельствует о неполном сочетании, то реакцию сочетания повторяют с той же сс -защищенной аминокислотой. 8 результате нескольких таких сочетаний получают промежуточный продукт - смолу., содержащую защищенный тетрапептид. Эту пептидсодержащую смолу расщепляют с одновременным удалением защитных групп в аппарате "Ке1-Р, используя безводный фтористый водород при ООС в течение 60 мин,в присутствии 1,2 мл анизола на грамм пептидсодержащей смолы.

Реакционную смесь, содержащую пептидный продукт, промывают безводным диэтиловым эфиром и экстрагируют водной .кислотой. Полученный экстракт лиофилизируют и высушенный таким образом пептид хроматографируют на Био-Геле P-6 в 1 N уксусной кислоте. Полученный полипептид имеет 983-ную степень чис5 9806 тоты, характеризуется аминокислотной последовательностью

Н - Аlа - Lys - Ser — Glu - ОН

Для идентификации используют тонкослойную хроматографию и электрофо- 5 рез, при которой тонкослойную хроматографию проводят на пластинках с тонким слоем силикагеля (силикагель компании

Бринкман с флуоресцентным индикатором) толщиной 0,1 мм. Пластинки разме10 ром 20 20 см. Хроматографирование проводят с использованием 30 мкг образца исследуемого пептидного продукта и следующих элементов

Rf н-бутанол: пиридин: уксусная кислота: вода = 30: 15: 3: 12

R f этилацетат: пиридин: уксусная:: кислота:вода = 5:5:1:3

R f этилацетат:н-бутанол:уксусная кислота: вода = 1: 1: 1: 1. 20

Элект роферетическое исследование проводят на образце весом 100 мкг с использованием 3-миллиметровой Ватмановской бумаги (11,5х56,5 см) и пиридин-ацетатного буферного раствора с рН 5,6. Электрофорез осуществляют при

Пример, N R X Y

0-Аl а

МН2

Sar

Sar

Sar

0-Аla 0-Аlа

D-Ala Sar

Sar 2-Ne А1а

Н, Sar

Sar

IVg

6064 (производства фирмы Истмен Кодак, размером 20 20 см) и использованием в качестве элюента системы растворй"

2 телей н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода в отношении 15:10:3:12 (Rg)

Электрофорез проводят на образцах весом 50 мкг, которые наносят на бумагу Ватман И 3 (размер листа 5,7 < з55 см ), используя пиридин-ацетатный буферный раствор и разность потенциалов между электродами 1000 В; электрофорез в этих условиях продолжают в течение 1 ч. Для опрыскивания тонкослойных хроматограмм и электрофоретограмм с целью проявления пятен испольДля идентификации и доказательства гомогенности полученных пептидов использованы тонкослойная хроматография и электрофорез, которые проводят следующим образом: для тонкослойной хроматографии использованы образцы продуктов весом 20 мкг, хроматографию проводят на пластинках с тонким слоем силикагеля (Кизельгель фирмы Керк, ФРГ, размер пластинок 5 20 см), используя в качестве элюента систему растворителей: н-бутанол-уксусная кис55 лота - этилацетат-вода в объемном отношении 1: 1: 1: 1, а также на пластинках с тонким слоем целлюлозы марки

15 6 найряжении 1000 В в течение одного часа. Для опрыскивания тонкослойных хроматографических пластинок и элект рофореграмм используют реагент Паули и раствор нингидрина. В итоге получают следующие результаты: !К = вещество осталось на старте, R вещество осталось на старте и Rf 0,336.Элект > f рофорез в указанных условиях приводит к перемещению вещества на 9„4 см по направлению к катоду.

Пример ы !!-IV .

Используя способ, аналогичный вышеописанному, для получения замещен" ных полипептидов, синтезирован ряд полипептидов общей формулы

° 1

R- X- Lys -Y- G!u" R

Эти пептиды получают твердофазным, методом, с использованием в качестве твердой полимерной подложки бензгидриламинной смолы.

Результаты получения этих пептидов представлены в табл, 1.

Табли.ца

7 980615 8 зуют реагент Паули и раствор нингид- ществ при электрофорезе приведены отрина. носительно тех же величин для эталонРезультаты получения представлены ного пептида Н-Arg-Lys-Asp-Val-Тугв табф. 2 (величины Rf и пробег ве- -ОН ).

Таблица 2

Электрофорез

Пример, h

Ниграция продуктов

Степень чистоты продуктов, ф

0,44

0,68 2,07

0,60 1,78

0,,71 2,10

0,88

98

0,56

СН СО - Sar - Lys - Sar - Gln QH

8 результате использования аналогичных методик тонкослойной хроматографии и электрофореза для исследования пептидного соединения, полученного в примере IV было показано, что для него свойственны следующие характеристики: R =(О, 155 ), К вещество остается .на старте, R = 0,265; при

1 элвктрофорезе в указанных выше условиях вещество перемещается от старта на расстояние 13,1 см по направлению к катоду.

Пример V . Тетрапептидсодержащие смолы, имеющие защищенные остатки лизина и серина, полученные, какописано в примерах 1 и 11, ацилируют уксусным ангидридом в соответствующих условиях, после чего удаляют защитные группы и отщепляют полимерную подложку. В итоге получают следующие ацилированные производные

СНЭСО - Ala — Lys - Ser - Gln - ОН

Пример VI Защищенные тетрапептидные смолы, полученные,как описано в при" мерах I u I l,переэтерифицируют сметилатом натрия в метиловом спирте в условиях, О обеспечивающих протекание реакции переэтерификации, приводящей к отщеплению пептидных продуктов от полимерной подложки. Последующее удаление защитных групп от полученных продуктов пе- ы реэтерификации приводит к получению этерифицированных пептидных производных, соответствующих формулам

Н вЂ” Ala - Lys - Ser - GInOCH>

Н вЂ” Sar - Lys - Sar — Gl nOCH

Э

Пример Ч1 I . Тетрапептидсодержащие смолы, имеющие защищенные остатки лизина и серина, и полученные, как описано в примерах 1 и II<, подвергают обработке диэтиламином с целью отщепления защищениых пептидов от твердой полимерной подложки в условиях, обычных для проведения реакций такого рода. Последующее удаление защитных групп приводит к получению следующих диэтиламидных производных указанных пептидов

Н - Ala — Lys - Sar - Gl n.-Н (С Я )

Н - Sar - Lys - Sar= Уп -Н(С Н <)>

П р и м e p VIII Используя методы

) описанные в примерах I и Il, но замещая И-концевые остатки зланийа и серина этильными группами, на заключительном. этапе пептидного синтеза вместо защищенных аланина и сарколизина в реакцию сочетания вводят эквивалентные количества соответствующим образом защищенных й-Ы-этил-L-аланина или

Й-с(-этил-сарколизина, в результате чего получают следующие й-этилированные пептиды

И

С Я - А!а - Lys - 1ег - Gln - ОЯ .

С Н - Sar - Lys - Sar - Gln - ОН.

Пример IX. Открепление защищенных тетрапептидов, полученных в примере Vill от смолы с использованием раствора аммиака в диметилформамиде в условиях, обычных для проведения реакции амидирования, с последующим

9 980615

Продолжение табл. 3

Ql y

XIV

Ы у-С1у

XV-I

XVII

XVIII

XIX

С1п G1у-GIy

Gln Gly-Gly-Ser

Sar Qly

Sa r . Q l y-G I y

ХХ

XXI

XX I I

Sar G l y-G I y-Ser

XX I I 1

2$

ХХ1Ч

Анализируя полученные пептидные продукты методами тонкослойной хромаЗО тографии и электрофореза, при использовании соответствующих методик, описанных к примере I для соединений, описанных в примерах Х1 и Х1I

Полученные результаты представле э ны в табл. 4.

Таблица 3

ОН

Яп

XI I

0Н

Таблица4

Е

Пример

Электрофорез ,Ииграция по напрвлению к катоду, см

На старте На старте 0,303

7,4

8,3

X I I

На старте На старте 0,186 г формула изобретения . Способ. получения полипептидов об,щей формулы

R -Х- Lys -Y - Gln -R, ss где Х " Sar, L-Аlа, 0 Ala;

Y - Ser, 5аг, D-A I a, 2MeAIa; .

R - Н, СН,СО, С,Н, Р - ОЙ, W,, I

1 удалением защитных групп приводит к получению амидов соответствующих N- этилированных пептидов

С(Н - Ala - Lys - Ser - Gl и - йН 2.

С Н -. Sar - Lys - Sar - Gln - ННд

П р и и е. р Х. Защищенные ацетилированные тетрапептидные смолы, полученные в примере V, подвергают обработке раствором аммиака в диметилформамиде в условиях, обычных для проведения реакций амидирования, и после удаления защитных групп получают следующие амиды пептидов

СН>СО -, Ala - Lys - Ser -: Gln - МН

СН СО - Sar - Lys - Sar - Gln - NH<

Э

IT р и м е р ы ХI-XXVI При использовании совокупности реакций и методов, описанных выше, для удлинения пептидной цепи, получены следующие полипептиды, замещенные по, концевым амико- и карбоксильным группам радикалами R и R

Р- Аlа - Lys - Ser - Gln - R >

I где R u R обозначают заместители при аминокислотных остатках, приведенные в табл. 3.

Используя методики проведения тон, кослойной хроматографии и электрофореза, описанные в примерах 1I и III для соединения примера XXII получены т следующие характеристики: Р =0,23, R< 0,25, электрофоретическая миграцйя (перемещение ) по направлению к катоду = 0,88.

Н, Glу-Glу-Ser .

Н G1у-G1у" Ser-Asn

Gln Gly

Sar : Gly-61у-Ser-Asn

G In Gly"Q1 y-Ser-Asn

Составитель В. Волкова

Редактор М. Товтин Техред М.Кощтура Корректор Н. f

Заказ 9395/50 Тираж 445 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по -делам изобретений и открытий

113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

11 980615 отличающийся тем, что замещенный по аминогруппе 1 -глутамин присоединяют к нерастворимой полимерной смоле ковалентной связью предпочтительно в среде абсолютного этанола при +80 С, удаляют а -аминозащитную группу oT L-глутамина обработкой про.дукта присоединения аминокислота-полимерная смола трифторуксусной кислотой, деблокированную аминогруппу L- 10 глутамина подвергают взаимодействию с У-аминокислотой, защищенной по с4аминогруппе, используя предпочтительно карбодиимидный метод, после удаления с -аминозащитной группы обработкой трифторуксусной кислотой, продукт вводят во взаимодействие с L-лизином, защищенным по d,-аминогруппе, предпочтительно используя карбодиимидный метод, полученную защищенную по о -амино-20 группе трипептид- полимерную смолу деблокируют обработкой трифторуксусной кислотой и трипептид-полимерную смолу конденсируют с М-R-замещенной Хаминокислотой, защищенной по ее о -ами- ногруппе, предпочтительно используя карбодиимидный метод; обработкой полученного продукта кислотой, если R-OH, или аммиаком в диметилформамиде, если R - NH, отщепляют пептидную цепь ! от смолы и деблокируют защищенный пептид обработкой трифторуксусной кисло- той и в случае использования бензгидриламиновой смолы { R - -NH>) независимо от обработки продукта кислотой или аммиаком.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве. полимерной смолы используют хлорметилированный полистирол дивинилбенэола и бензгидриламиновую смолу.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Шредер Э., Любке К.Пептиды. Ч. I, М., "Мир", 196/, с. 398.

Z. Ногiki К., igano К., inonye К.

Symthes s оФ the Herrifiе1d Res n esters of N-protected amino acids with

the aid оФ Hydrogen bouding. Chem.

Letters, 1978, с. 165.