Питательная среда для культивирования коринебактерий дифтерии

 

ПИТАТЕЛЬНАЯ CPEJB. ДЛЯ .КУЛЬТИВИРОтНИЯ КОРИНЕБАКТЕРИЙ. ДИФТЕРИИ, содержащая питательную ocHOiVf факторы роста, хлористый натрий,агар-агар и воду, о т л и - чающаяся тем, что, с целью улучшения ростовых свойств и повышения элективности, в качестве питательной основы она содержит сухой ферментативный гидролизат крови животных, .в качестве факторов роста сухой экстракт кормовых дроиокей и цистеин хлористый, дополнительно содержит активированный уголь при следующем соотношении компонентов, . мае.%: Сухбй ферментативный гидролизат крови 1,4-1,6 животных Сухой экстракт 0,25-0,50 кормовых дрожжей 0,001-0,002 Цистеин хлористый 0,35-0,40 Хлористый натрий Активированный 0,3-0,5 уголь 1,8-2,5 Агар-агар Дистиллированная Остальное. вода О СП hi :л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

3(51) С 12 N 1 20

)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, Сухой ферментативный гидролизат крови животных

1,4-1,6

Сухой экстракт кормовых дрожжей

0 25-0,50

0,001-0,002 д

0,35-0,40

Цистеин хлористый

Хлористый натрий

Активированный уголь

0,3-0,5

1,8 2,5

А г ар-агар

Дистиллированная вода остальное, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

И ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3274020/28-13 (22) 11. 02. 81 (46) 07.01.84. Бюл. Р 1 (72 ) И.Л. Маргулис, В.А . Бочкова, Н.N. Головина, Б.M. Раскин и В.A .. Мель никова (71) Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г .Н.Габричевского (53 ) 576 ° 8 ° 095 (088 -8 ) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

Р 596619, кл. С 12 К 1/06, 1976.

2. Большая медицинская энциклопедия. N . "Советская энциклопедия"

:1980, иэд. 3, т. 13, с. 430-431 (прототип). (54) (57) ПИТАТЕЛЬЕИ.Я CPE3h, ДЛЯ

КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КОРИНЕБАКТЕРИЙ, ДИФТЕРИИ, содержащая питательную осно у, факторы роста, хлористый натрий, агар-агар и воду, о т л и ч а ю щ а я с я тем, что, с целью улучшения ростовых свойств и повы.,sU 116,иод А шения элективности, в качестве питательной основы она содержит сухой ферментативный гидролизат крови животных, .в качестве факторов ростасухой экстракт кормовых дрожжей и цистеин хлористый, дополнительно содержит активированный уголь при следующем соотношении компонентов, мас.Ъ:

1065475

Цель изобретения — улучшение ростовых свойств и повышение элективности.

Цель достигается тем, что питательная среда для культивирования коринебактерий дифтерии, содержащая. питательную основу, факторы роста, хлористый натрий, агар-агар и воду, З0 в качестве питательной основы содержит сухой ферментативный гидролизат крови животных, в качестве факторов роста — сухой экстракт кормовых дрожжей и цистеин хлористый, допол- 35 нительно содержит активированный уголь при следующем соотношении компонентов, мас.Ъ:

Сухой ферментативный гидролизат крови, 40 животных l,4-1, б

Сухой экстракт кор мовых дрожжей

0,25-0,50

0,001-0,002

0,35-0,40

Цистеин хлористый

Хлористый натрий

Активированный уголь

0,3-0, 5

825.50

Агар-агар

Дистиллированная вода

Остальное

Новая питательная среда используется без добавления нативиых белковых продуктов (сыворотки, крови).

Ферментативный гидролиэат крови животных является стандартным препаратом, содержащим: 13,0-14,0Ъ общего азота, 9,0-10,0Ъ аминного 60 азота, 8,0-9,0Ъ хлоридов и 16 свободных аминокислот (триптофан, гистидин, аргинин, треонин, серии, пролин, глицин, алании, валин, метионин, изолейцин, лейцин, тиро-.

Изобретение относится к медицине, преимущественно медицинской микробиологии, и может быть использовано при получении биомассы коринебактерий дифтерии, их типировании, идентификации. 5

Известна среда для культивирования коринебактерий дифтерии с целью их дифференциации от дифтероидов (Ц .

Однако при высеве на данную питательную среду 100 микробных тел уда- 10 ется получить лишь 12-15 колоний.

Известна среда для культивирования коринебактерий, которую готовят из отвара .говяжьего мяса с добавлением натрия хлористого Я . 15

Однако выход биомассы при культивировании на ней коринебактерий дифтерии низкий, что требует добавления к ней сыворотки крови животных или дефибринированной крови. Кроме того, элективность данной питательной среды низкая.

I зин, фенилаланин, аспарагиновую и глутаминовую кислоты).

Новая питательная среда приготавливается следующим образом.

Сухой гидролизат крови животных, сухой экстракт кормовых дрожжей и хлористый натрий растворяют последовательно в дистиллированной воде при нагревании до 80"С, затем добавляют необходимое количество arapa u доводят до кипения. Кипятят до полного растворения агара. Устанавливают pH=7,8-7,9 10Ъ-ным раствором едкого натра, кипятят 5 мин, затем добавляют цистеин хлористый и активированный уголь. Питательную среду наливают в стерильные флаконы и стерилизуют при 110-112ОС в течение 30 мин.

Пример использования новой питательной среды. Оценку ростовых свойств питательной среды проводят путем посева серийных разведений взвеси суточной культуры коринебактерий дифтерии. Результаты учитывают через 24 ч ° Критерием оценки изучаемых сред считают наличие роста при посевной дозе, равной 100 и

50 микробных клеток, а также размер и характер выросших колоний. Для посева используют штаммы коринебактерйй дифтерии с различными биологи-, ческими свойствами (токсигенные и нетоксигенные, по биохимическим свойствам тип Гравис и тип Митис).

Контролем служит среда Мартена.

Для определения выхода микробной массы 1 мл взвеси суточной культуры коринебактерий дифтерии, содержащий

1 млрд, микробных тел, засевают на матрацы с испытуемой и контрольной средой. Капля равномерно распределяется по поверхности среды при помощи стеклянных бус. Матрацы помещают в термастат при 37ОС на 24 ч. Затем культуру смывают физиологическим раствором и определяют густоту взвеси по оптическому стандарту.

В табл. 1 приведены испытанные варианты новой питательной среды.

Ростовые свойства вариантов среды, включающих представленные в таблице сочетания, определяют путем посева серийных разведений б штампов коринебактерий дифтерии. Учет результатов производят через 24 ч .

При этом учитывают процент колоний;

BblpocLIHx при посеве 50 и 100 клеток, и характер колоний. Наличие роста от мечено на вариантах: 2, 3, 5, 8, 9, 10. На вариантах 2, 3, 8, 9 числО выросших колоний соста ило 70-80%, на варинатах 5 и 10 -. 60% ° Рост на варианте 9, содержащем 6,0 г/л активированного угля, пышный, но слизистый, мало характерный для коринебактерий дифтерии. На вариантах б

1065475 и 7, содер>кащих цистеин в количествах ниже 0,01 г/л и выше О, 02 г/л, рост очень скудный и состав яет менее ЗОВ по отношению к посевной дозе. При увеличении хлористого натрия до 6,0 г/л число выросших . колоний снижается до 30,0-35,0Ъ.

К таким же результатам приводит уменьшение активированного угля до 2,0 г/л.

Оптимальными количественными соотношениями компонентов среды являются следуюшие: гидролизат крови - 15,0 г/л; натрий.хлористый

4,0 г/лу цистеин — 0,01 г, л; активированный уголь — 3,0. г/л (вариант 2). Сочетание этих компонентов в,данных количественных соотношениях обеспечило получение максимального выхода биомассы при культивировании всех испытанных штаммов коринебактерий дифтерии.

Выход биомассы на этом варианте среды составляет 7,5-8,0 млрд. микробных тел с 1 мл среды. При ис пытании вариантов 3 и 8 выход микробной массы колеблется в зависимости от посеянных ытаммов в пределах 6-8 млрд. микробных тел с 1 мл среды.

В табл. 2 приводятся данные опытов, позволивших установить предельно максимальные, оптимальные и предельно минимальные дозы

4-х компонентов питательной среды (хлористого натрия, гидролизата крови, цистеина и активированного угля). Опыты проводили с 18 ытам мами коринебйктерий дифтерии с различными биологическими свойствами.

Высокий уровень биомассы новая питательная среда обеспечивает лишь при определенном соотноыении входящих н нее компонентов. . Выход микробной массы с 1 мл новой среды в 3 раза превышает выход микробной массы со среды Мартена.

Свойства среды Мартена приближаются к свойствам новой среды только после добавления к среде.®бертена 10% сыворотки крупного рогатого скота.

Результаты излучения влияния со- держания антивированного угля в пи-. тательной среде на ее ростовые свой- ства и вы",îä микробной массы в срав. нении со свойствами среды Мартена представлены в табл. 3.

Как видно из таблицы, питательная среда с оптимальным количественным. соотношением компонентов приобретает новые качественные свойства толькб при добавлении оптимальной дозы активированного угля. Добавление

10 активированного угля в той же дозе к среде Мартена не дает эффекта °

Метод серологической идентифика-. ции коринебактерий дифтерии используется с целью определения видовой

15 и типовой принадлежности выделенной культуры для дифференциации дифтернйных микробов от других представителей рода коринебактерий. Метод вклнчает 2 этапа: 1 — агглютинация на стекле для определения родовой принадлежности; !! — линейная агглюти.ыция в пробирках с типовыми сыворотками. для реакции агглютинации на стекле используют суточную куль уру, полученную со среды культивирования. На этом этапе культуры, полученные со среды Мартена, плохо гомогенизируюшиеся, часто дают хлопья и дальые не изучаются., Взвесь, полученная с новой питательной среды, гомогенна и хорошо типируется. Результаты типирования представлены в табл. 4.

Приведенные в таблице даннйе свидетельствуют об улучшенных cBoAGT

35 вах новой среды, проявляемых при серологической ир.ентификации и серотипировании коринебактерий дифтерии.

Культура, полученная с новой среды, хорошо гомогенизируется и это оп40 ределяет четкие результаты в реакции агглютинации, тогда как взвесь культуры, полученной со среды Мартена, почти в 40% случаев содержит хлопья, имитируюшие спонтанную агглютинацию

45 в контРоле.

Таким образом, новая питательная среда обладает улучшенными ростовыми свойствами, обеспечивает повышение выхода биомассы коринебактерий дифтерии и обладает повышенной элек тив» ос тью.

1065475

Таблица 1

" (омпонен ты

Дозы, г/л

10.

6 7

Гидролизат крови

14,0 15,0 16,0 15,0 14,0 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0

Натрий хлористый 5,0

4,0 4,0 4,0 3,5

4,0 40 6 0 3 5

Цис теин хлористый 0,01

0,01 0,02 0,01 0,01 0,03 0,005 0,01 0,01 0,01 !

Активированный уголь 2,0

Зг0 3rO 3tO 4tO 4iO 4rO 5iO 610 3,0

Таблица 2

Характер роста

Недостатки !

Дозы компонентов, г/л гидролизата крови активированного угля цистеина натрия хлористого!

3,0 80-90 7-8

Onтималь— ные дозы

0,01

4,0

15,0

М инималь— ные дозы

4,0

0 О1 3 0 70-80 6-7.

0,01 3,0 70-80 6-7

14,0

3 5

15,0

То ке

Предель но максимальные дозы

4,0 0,01 4,0 60-80

0,01 5 0 50-70 5-7,5

4,0

6-7

0 02

4,0

То же

5-7

4,0 0,01

16,0

Около 6

4,0

0,02

16,0

15,0

15,0

15 0

Число колоний по отношению к посевной дозе, В

3,0 70-80

3,0 65

3,0 50

Выход микробной массы, млрд . микробных тел

1065475, Продолжение табл. 2

Недостатки

Характер роста активированного угля

0исло колоний по отношению к посевной дозе, %

Выход микробной натрия хлористого

Гидролизата крови цистеина массы, млрд, микробных тел

Дозы, не обеспечивакщие положи. тельный эффект, 2, 5-3

0,01

3iO

15,0

40-50

3,0

0401

60-70 6

15,0

4,5

3,0

15,0

50-60

30-35

4, 5-6

5,0

0,01

3,0

То же

15,0

6,0

2,5-3

0, 01

3,0

2,0 0- 30

4,0 . 0,01

15,0

При наличии ростадо :

1,5 млрд, Очень слабый рост

150 4 0 003. 3 0 20 25

То же

"P-2,5

0,005 3,0 Е-ia

15 0 4,0

При наличии " роста— до

1 млрд.

6-7

0 01 6,0 60-70

Рост слизистый, не характерный

4,0

Дозы, не обеспечивающие положительный эффект

Дозы компонентов, г/л

Колонии мелкие, небольшой выход микробной массы, при увеличении дозы NaCl колонии мелкие, сухие, выход массы низкий

1065475

Таблица 3

Ростовые свойства

Количество изучен ных штамЧисла опытов

Среда

MO FРазмер колоний, мм

Питательная (оптимальный вариант) без угля

0,2-0,3 2,5"3,0

33,0+5,4

Питательная (апти" мыльный вариант) +

0,3% угля

85,0" 5,6

30,0 3,2

6,0-8,0

2,0-2,5

О, 5-9,8

0,1-0, 2

18

Среда Мартена

Среда Мартена+

0,3S угля

32, О+6, 5

2,0-2, 5

0,2

Та б лица 4

Число изученных штаммов, о

Количеств во серий среды

Среда

Выделено Протипировано

96,6

Предлагаемая

Среда Мартена

63,3

Составитель Л. Серова

Редактор Т. Кугрышева Техред K,Гергель Корректор О.Тигор

Процент выосших ко=. оний по о тноше ншо к посевной азе (100 м.т.) Заказ 11008/30 Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/ 5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Выход микробной массы с 1 мл среды в млрд а микробных тел