Способ получения антибиотика @ -19393 @ и/или @ -19393 @
Способ получения антибиотика общей формулы СНз щ . Н ИНСОСНз соон где -R-SOjH - антибиотик С-19393 Sj и/или R-Н - антибиотик С-19393 З ЛЮЧаЮЩИЙСЯ в том, что ШТс1ММ Streptomyces С-19393 (iFo 13,886) культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, и выделяют целевой продукт С/) КЗ жидкой фракции культуральной рреды в виде смеси и/или отдельных антибиотиков . Приоритет по признакам: 02.02.79 при получении антибиотика C-19393S2; 06.06.79 при получении антибиотика С-19393Н2. «vl ел со СХ)
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК
„„SU„„7 4 А
3(51) С 12 P 1 06
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
Il0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ! выд ва
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА
С-19393 S И/ИЛИ С-19393 Н (57) Способ получения антибиотика общей формулы
Qlg сн — e К
R-О н ъкеоск с=с (21) 2878699/28-13 (22) 01.02.80 (31) 11560/79;81141/79 (32) 02,02.791 26 ° 06.79 (33) Япония (46) 23.02.84. Бюл. М 7 (72) Акира Имада, Сецуо Харада и Мицуко исаи (Япония) (71) Такеда Кемикал Индастриз
Л.Т.Д. (Япония) (53) 615.779.931(088.8) 3
О соон где -R-803Н вЂ” антибиотик С-19393 82 и/или R-H — антибиотик С-19393 Н
2 заключающийся в том, что штамм
Streptomyces С-19393 (iFo 13,886) культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и 6 азота, и выделяют целевой продукт из жидкой фракции культуралъной.среды в виде смеси и/или свдельвых ви- Се тибиотиков.
Приоритет по признакам:
02.02 ° 79 при получении антибиотика С-19393S2, 06.06.79 при получении антибиотика С-19393Н
1075984
О н
meOm3.
СОЮИ
25
Таблица l
Бесцветная
Нет
Белый
Глюкоза аспара-. гиновый агар
Незначительный
Глицерин.аспара гиновый агар
Умеренный
Крахмальный агар
Охра
Нет
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового антибиотика.
Целью изобретения является полу-. чение нового антибиотика общей формулы Я 30
Длв(МИОЙИН)
ОООН где R-ЯО Н вЂ” антибиотик С-19393 Я и/или R-Н - антибиотик С-19393 Н .
Цель достигается тем, что согласно способу получения антибиотика общей формулы где,R-SO H — антибиотик С-19393 S
2 и/или RQI - антибиотик С-19393 Н2 который заключается в том, что штамм Streptomyces С-19393 (iFo
13,68б) культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, и выделяют целевой продукт из жидкой культуральной среды в виде смеси и/или отдельных антибиотиков.
Для получения антибиотика
С-19393 Я и/или Н изобретения используются микроорганизмы, произво-. дящие антибиотик С-19393 S и/или
Н, принадлежащие к разновидности 40
Streptomyces sp. Типичным примером
Сахароза нитратный агар Умеренный такого микроорганизма является штамм Streptomyces sp С-19393, который получают посевом суспензии образцов почвы, собранной в Швеции, в стерильной воде на культурную среду, состоящую из 1% растворимого крахмала, 0,05% мочевины, 0,05% полипептона (Dalgo Nutritive
Chem.Ltd) 0,05% дрожжевого экстракта (Difco uSA), 0,02% фосфата калия, 0,02% хлористого калия, 0,01% сульфата магния, 5 мг/мл блеомицина и 2% агара, имеющего рН 7,0 и повторяющейся очисткой микроорганизма из колонии, полученной в ходе культивирования при 28 С в течении о
2 недель;
Штамм С-19393 разновидности
Streptomyces имеет следующие микробиологические характеристики.
Морфологические характеристики.
Воздушный мицелий, имеющий ширину около 1рс., вытягивается от хо" рошо разветвленного вегетативного мицелия и моноподиально ответвляется от главной оси с образованием боковых цепей. Прямые или слегка изогнутые споровые цепи, наблюдаются на конце боковой цепи. Каждая спора имеет цилиндрическую форму (0,35-0,55-0,7-1,4) и имеет гладкую поверхность. Никаких специальных органов, таких как сферические спорангии, склероции, а также подвижныв спор не наблюдается.
Культуральные характеристики.
Культуральные характеристики штамма в различных средах представлены в табл.1. Представленные характеристики наблюдали после культивирования при 28 С в течение 2 недель.
1075984
Продолжение табл. 1
Питательный агар
Слоновая кость
Белый
Тиризиновый агар
Бесцветная
Нет
Сероватожелтый
Дрожжевой экстрактЭкстракт мальтозы агар
Овсяно-мучной агар.Бесцветный
Белый
Штамм С-19393 обильно растет на среде, содержащей 2Ъ овсяной муки, 2% томатной пасты, 0,2Ъ Bovri8 и 2% агара, имеющей рН 7,0 и происходит обильное образование серовато-желтого воздушного мицелия. Растворимого пигмента не образует.
Физиологические характеристики.
Температурный интервал роста: нижний предел ниже 15 С;. верхний предел 32-35 С; оптимальная температу- 30 ра 26,5-30оС.
Желатин разжижает, крахмал гидролизует, пептонизирует снятое молоко, но не коагулирует. Меланоидных пигментов тирозин-агар, и пеп- 35 тон-дрожжевой экстракт-железо-агар не образует.
Хорошо усваивает следующие источники углерода — глицерин, D-кслоэу, L-арабинозу, D-глюкозу, D-галактозу, D-фруктозу, мальтозу, рамнозу, крахмал. Слабо усваивает инозит, целлюлозу. Не усваивает D ìàííèò, сахарозу, рафинозу.
Штамм Streptomyces С-19393 депонирован в Fermentation Reseach last, 45
Agencyof Ind.Science and Technology
FERM-P 9 4774 в институте ферментации. Осака под номером iFo 13886 и в American Type Cuture СоИ ection под номером AMCC 31486.
Штамм Streptomyces С-19393 (iFo 13886) культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в качестве источников углерода могут быть использованы глюкоза, крахмал, глицерин декастрин, сахароза, студень иэ проса, маласса,. Примером источника азота могут быть мясной экстракт, высушенные дрожжи, дрожжевой экст- 60 ракт, соевая мука, кукурузный экстракт, пшеничные почки, хлопковый цвет, сульфат аммония, нитрат аммония. При необходимости могут быть использованы неорганичес- 65 кие соли такие как карбонат кальция, хлористый натрий, хлористый калий, соль фосфорной кислоты, а также органические и неорганические вещества, которые способствуют росту микроорганизма и могут добавляться в питательную среду в соответствующих количествах.
Кроме того, в среду могут добавлять соли тяжелых металлов, как сульфат железа, сульфат меди, а также витамины В, биотин., В среду могут добавлять противопенные и поверхностно-активные агенты, такие как силеконовые масла, эфир полиалкиленгликоля.
Культивирование осуществляют в твердой или жидкой среде в условиях аэрации. Культивирование ведут при 15-32 С, рН 4-8 в течение
8-168 ч, предпочтительно 24-144 ч.
Антибиотик С-19393 S> и Н производят внешнеклеточно и в фврментационном бульоне, отделяют полученную культуру от микробиальных клеток и верхний слой жидкости центрифугированием или фильтрацией, а затем отделяют антибиотик от верхнего слоя жидкости. Однако антибиотик может быть также получен непосредственно из ферментацион-.. ного бульона.
Выделение С-19393 S> и Н может производиться по методике обычно используемой. для выделения. метаболитов, производимых микроорганизмами. Так, например, поскольку
С-19393 S и Н представляет собой водно-растворимое кислотное соединение, вырабатываемое, главным образом, внешнеклеточно, методика, включающая удаление микробиальных клеток фильтрацией или центрифугированием и отделение, очистку и сбор. активнОго вещества иэ фильтрата обычно используется для выделения
С-19393 SÄ и Н . Таким образом, раз2
1075984 личные средства, использующие различие в растворимости и степени растворимости в различных растворителях, различие в природе осаждения и скорости осаждения и различие в,адсорбционной: способности, а также ионо-обменная хроматография, хроматография на молекулярных ситах, концентрация при пониженном давлении и сушка замораживанием и т.п. могут использоваться сами по себе или в подходящей комбинации в любом порядке и с любым числом повторений;
Примерами подходящих адсорбентов могут служить активированный уголь, адсорбционные смеси, анионо-обменные смолы (анионного типа), порошкообразная целлюлоза, силикагель и т.п. или носители, обладающие свойствами молекулярных сит. Примерами элюирующих растворителей, которые могут использоваться, могут служить водные растворы водно-растворимых растворителей, =аких как ацетон, метанол, этанол, пропанол, бутанол, изопропанол, изобутанол и т.п. или водные растворы кислот или щелочей, или буфферные или водные растворы неорганических или органических солей, хотя используемые растворители могут изменяться в зависимости от типа носителя.
Ферментационный бульон, полученный после завершения культнвации, фильтруют с использованием фильтрующего средства с целью удаления микробиальных клеток. Полученный в результате фильтрат пропускают через колонку с активированным углем в нейтральных или слабо-кислых условиях и адсорбированный антибиотик
С-19393 S элюируют водой или гид2 рофильной растворительной системой °
Большая часть антибактериальной активности обнаружена в водном элюате.
Поскольку антибиотик С-19393 S
2 является по природе кислым, такие анионо-обМенные смолы типа С0 или
АсО, как Амбердит 1РА-400, 402 и 410 могут применяться для дальнейшей очистки. Из полученного в результате элюата антибиотического соединения, активное вещество дополнительно элюируют водным раствором хлористого натрия или буфферным раствором. Обессоливание элюата достигается слабым подкислением элюата и хроматографической обработкой элюата активированным углем с последующим элюированием водным раствором спирта и т.п. Элюат, содержащий активное соединение, концентрируют при пониженном давлении при низкой температуре и к концентрату добавляют этанол или метанол.
Полученный осадок удаляют фильтрацией и полученный в результате водно-спиртовой раствор вновь концентрируют при пониженном давлении. К концентрированному осадку добавляют ацетон или аналогичное соединение и осадок отделяют фильтрацией. Полученный в результате порошок может быть подвергнут дополнительной хроматографической обработке с использованием колонной хроматографии с комбинацией фаз
DEAE или ЯАЕ Сефадекс в СО -форме и адсорбента — смолы XAD или высо. ко пористой смолы типа Диаион
HP-20. Водный раствор порошка, полученный выше, адсорбируют на
f . DEAE Сефадексе А-25 (в СР— форме) и после промывания водой колонку элюируют 0,4 M водным раствором хлористого натрия. РН элюата уста2О навливают равным 5 и его подвергают колонному хроматографированию с использованием активированного угля. Элюирование с колонки с активированным углем проводят с ис25 пользованием водного изобутанола, однако лучший результат получают при элюировании в нейтральных или слабо-щелочных условиях, которые создают добавлением разбавленного .
)() водного раствора аммиака и т.п.
Эатем полученное в результате соединение подвергают колонной хроматографии с использованием XAD-11 илу HP-20 ° Адсорбированное активное вещество фракционно элюируют водой.
Активные фракции собирают и концентрируют, и концентрат подвергают хроматографической обработке на Ко лонке с QAE-Сефадексом A-25 (СГ -форма), после чего элюируют 0,02 M водным раствором хлористого натрия.
Полученный элюат обессоливают хроматографированием на активированном угле тем же способом, как описано выше. Элюат концентрируют и концент45 рат подвергают колонной хроматографии с использованием фазы из XAD-11, после чего проводят элюирование и фракционирование водой. Как было установлено, полученные фракции да50 ют единственный пик на жидкостной хроматограмме, как будет показано ниже. Активные фракции обьединяют и концентрируют досуха при пониженном давлении, при низкой температуре и
55 к остатку добавляют ацетон или аналогичное соединение с образованием
С-19393 Я2.
Ферментационный бульон, полученный после завершения культивации, фильтруют с помощью фильтрующего средства для удаления микробиальных клеток. Полученный в результате фильтрат пропускали через колонку с активированным углеродом в нейт65 ральных или слабо-щелочных условиях
1075984
H адсорбированный антибиотик С-19393
Н> элюируют с помощью гидрофильной системы растворителей. Поскольку антибиотик С19393 Н является ro природе кислым, для дальнейшей очистки с успехом можно применять анионообменные. смолы в форме Cf или
СН СОО", такие как Амберит IRA-400, 402, 410, Дууэкс-l, Диаион A-21A и
С. Активное вещество, дополнительно элюнруют водным раствором хлористого натрия или буфферным раствором.
Обйссоливание элюата осуществляют его нейтрализацией или слабым под- кислением и последующимхроматогра-.
Фированием через активированный уголь, .с последующим элюированием .водным раствором спирта и т.п.
Элюат, содержащий активное соединение, концентрируют при пониженном давлении при низкой температуре и к концентрату добавляют метанОл и этанол. Полученный осадок удаляют Фильтрапией и полученный в результате водный раствор спирта снова концентрируют нри пониженном цавлении. Для дальнейшей очистки полученного в результате концентрата с успехом можно применять колонную хроматографию с использованием комбинации DEAE или QAE Сефадекса в С8 -форме, а также адсорбцион ную смолу XAD или Диаион PH-20, т.е. полученный ранее концентрат пропускают через Диаион HP-20 и фракционно элюируют водой. Активные фракции концентрируют и концентрат пропускают через ДЕАЕ Сефадекс
A-25/СЯ -Форма. После промывания
0,02 М водным раствором хлористого натрия,. элюирование осуществляют
0,05 N водным раствором хлористого натрия. Яатем полученный в результате злюат пропускают через Диаион-
НР-20, который обрабатывают водным раствором хлористого натрия и элюиро вание проводят с помощью водного раствора хлористого натрия, содержащего метанол. Обессоливание элюата проводят с использованием хроматографирования через активирован.ный уголь,тем же способом, что описан выше. Полученный в результате элюат концентрируют и концентрат подвергают колоночной хроматографии с использованием Диаион HP-20. (50-100 меш) и фракционно элюируют водой. Активные фракции сливают и - . концентрируют и концентрат подвергают хроматографированию на колонке с использованием .фазы QAE Сефадекс A-25 (Cf -форма), которую обрабатывают 0,02 М раствором хлористого натрия; Фракционирование проводят с использованием 0,04 М водного раствора хлористого натрия
° и активные фракции обессоливают тем же способом, что описан выше с ,использованием хроматографии через активированный уголь. Элюат кон-, центрируют и концентрат подвергают
>.,хроматографированию на колонке с использованием Ач се(Э (кристаллическая целлюлоза) — и колонку элюируют и фракционируют 903-ным водным раствором пропанола. Получен10 ный элюат концентрируют и концентрат подвергают хроматографированию на колонке с XAD-ll (100-200 меш), после чего проводят элюирование и фракционирование водой. Активные
Фракции концентрируют и концентрат .подвергают препаративной жидкостной хроматографии,.после чего осуществ,ляют элюирование и фракционирование с помощью метанолсодержащего Фосфат ного буффера. Фракции, дающие на .
20 хроматограмме один пик, объединяют и концентрируют и концентрат подвергают хроматографированию на колонке с использованием
Диаион HP-20 (100-200 меш), пос25 ле чего проводят элюирование водой для удаления буфера. Элюированные активные Фракции концентрируют при пониженном давлении при
° низкой температуре и концентрат су-
30 шат вымораживанием с получением
С-19393 Н в виде белого порошка.
Соединения изобретения могут образовывать соль металла и аммонийную соль. Примерами солей металла могут
З5. служить натриевая соль, калиевая соль, литиевая соль и т.п.
Динатриевая соль С-19393 Sgg полученная в примере 1, имеет следующие физические и хииические свойства: внешний вид - белый порошок1 удельное вращение: (dj2 152 И5 (С0,5, в воде), Элементарный анализ, % (образец сушили над пятиокисью фосфора при
40 С в течение 6 ч): С 36,29 + lrOg
45 Н 3,72+0,5у N 6 0720,5; Na 9,70т
+1,0i g 31,0911 0; S 13,1311,0.
Количество кислорода расчитано . по балансу, т.е. вычитанием содержаний других компонентов.
Молекулярный вес (вычисленный в расчете на содержание 2 атомов
Ба/на молекулу) 528-429; молекулярная формула,C H<
УФ-спектр: спектр, снятый в воде и максимальные значения длин волк былц следующие: Д Н О 240 1 ф2 нм/Е = 296120/ и 285+2 нм/Е
245+20) .
ИК-спектр: спектр измеряли с образцами в таблетках KBr и имеет основные пики (волновые числа) были следующими: 3450, 3220, 3000, - 1770, 1700, 1630, 1515, 1395, 65 1240-1260, 1100, 1050, 1010, 980, 1075984
30
Та бли ца 2
Минимальная ингибирующая,,мг/мл
Микроорганизм
12,5,25
12,5
12,5
4() Proteus ль Идаг1в ? РО
3045
100
Proteus m1rabi0is
IFO 3845
Serratia marcescens
IFO 12648
АЮсаР1депев faccakis
IFO 13111
100
Comamonas ternigend
IFo 13299
6,25
12,5
Sarcina 3 utea
0,55+0 1 65 ХРо 3232
12,5
950, 915, 900, 860, 815, 795 760, 715, 670, 625, 590, 530 (см".") °
Тонко-слойная хроматография
Се И u lose F.
Система растворителей. Значение Rf. а) пропана: вода (4:l) 0,33+0,1 б) бутанол:уксусная кислота:вода (2:2:1) 0 54 0 1
c) пропанол:этанол-вода (5:2:3) 0,6210,1
Растворимость: нерастворимы в хлороформе, этилацетате, ацетоне частично растворимы в этаноле, бутаноле, пиридине; растворимы .в метаноле, диметилсульфоксиде, уксусной кислоте; легко растворимы в воде.
Цветные реакции: положительная реакция Эрлиха и с перманганатом 20 калия; отрицательная — реакции с нингидрином, Грейг-Либака, Драгендорфа, с хлорным железом и реакция
Сакагуши.
Натриевая соль С-19393 Н» полученная в примере, 2,представленном ниже, имеет следующие физические и химические свойства.
Внешний вид — белый порошок.
- Элементарный анализ (определенный 30 для образца высушенного над пятиокисью фосфора при 40 C в течение б ч): С 45,34+1,0; Н 4,9810,5; N
7,48 0,5; Na 6,15+1,0; Й 8,51+1,0.
Молекулярный вес (вычислено в 35 расчете на содержание одного атома Na на молекулу) 426-322. Молекулярная формула С14 Н < N 2 Иа806.
Удельное вращение: gg) — 134
2 (с = 0,156, в воде).
УФ-спектр: измеренный спектр имеет следующиемаксимальные значения длин волн: макс. Н О/Е = 242+
+2 нм/395+20) и 289+2 нм (314720) .
ИК-спектр: спектр, измеренный 45 в таблетке из KBr. имеет следующие основные пики (волновые числа):
3400, 2980, 2940, 1770, 1630, 1530, 1390, 1265, 1215,1130, 1090, 1065, 1040, 1000, 920, 840, 820, 790, 770, 5Р
620, 540, 450/см.
Циркулярный dichroism спектр (в воде): положительный эффект Коттона при 234 нм и отрицательный эффект Коттона при 206, 258, 292 мм.
Тонко-слойная хроматография (с использованием целлюлозы).
Система растворителей. Значение Rf а) пропанол:вода (4:1) 0,45+0,1 б) бутанол:уксусная кислота:вода (2 1:1) 0,67+0,1 с) бутанол:пиридин: уксусная кислота: вода (15:3:2:12), верхний слой
Цветные реакции: положительные—
Эрлиха реакции и с перманганатом калия; отрицательные - с нингидрином, Грейг-Либака, Драгендорфа с хлорным железом и реакции Сакагуши.
Растворимость: нерастворим в хлороформе, этилацетате; умереннорастворим в ацетоне, этаноле, и бутаноле; растворим в метаноле и воде.
Антибиотики С-19393 S и Н отно2- 2 сятся к антибиотикам р-лактального типа.
Антимикробный спектр натриевой соли антибиотика С-19393 S представ2 лен в табл.2.
Escherichia co(1 NIHJ
Safmone ffà typhimurium
IFQ 12529
KEebs1efka pnenmoniae
IFO 3318
Pseudomonas aeruginoва IFO 30801
Staphy(}ococcus aureus
209Р
1075984
Продолжение табл.2
Bacillus эиЪФЙХз
IFO 3513
l2,5
Вас1И us cereus
IFO 3460
) 100
Среда — бульонный агар.
Антибиотик С-19393 Я обладает также сильной бета-лактамазной ингибирующей активностью и, поэтому, он значительно повышает чувствительность различных бактерий, которые устойчивы к действию производных пинициллина и/или цефалоспорина, к действию этих агентов.
Антибиотик обладает активностью против грамположительных и грамотрицательных бактерий и поэтому он может быть использован при лечении бактериальной инфекции у млекопитаю25 щих, например мышей, крыс, собак, людей.
Для использования С-19393 S
2 при лечении инфицирования микроорганизмом вида Е.cori антибиотик растворяют в физиологическом растворе с целью приготовления раствора для инъекций, который можно применять парентерально, например подкожно или внутримышечно при дозе 35
2-200 мг/кг/день, предпочтительно, 5-50 мг/кг/день. В случае орального применения антибиотик С-19393 S смешивают с лактоэой и капсулируют
4 с целью получения капсульного пре- 4р парата, который можно применять с дозой 10-500 мг/кг/день, предпочтительно, 20-200 мг/кг/день.
Кроме того, антибиотик С-19393 полученный согласно изобретению, 45 можно использовать в качестве дезинфицирующего средства. Так, например, жидкий препарат, который может. быть получен растворением антибиотика С-19393 S в дистилли- 50 рованной воде с концентрацией 0,11,0 вес./об.Ъ или мазь, содержащая
2-50 мг, предпочтительно, 5-20 мг
С-19393 Я на 1 r белого петролатума или ланолина в качестве основы, может использоваться в качестве бактерицида или дезинфицирующего средсТва для обработки верхних и нижних конечностей, глаз, ушей и т.м ° у укаэанных выше животных.
Антибиотик С-19393 S2 обладает бета-лактамазной ингибиторной активностью и поэтому, значительно повышает чувствительность пенициллин или, цефалоспорин — устойчивых бактерий к действию ампициллина и 65 цефотиама из-за его способности производить бета-лактамазу. В соответствии с этим, С-19393 S может использоваться для лечения инфицирования у млекопитающих (например, у мышей, крыс, собак и людей), а также у птиц (например, куриц, уток), особенно бактериальных инфекций, обязанных действию беталактам-антибиотически устойчивых бактерий в комбинации с пеницилли" ном или цефалоспорином.
В том случае, когда антибиотик
С-19393 S используется в комбинации с другими средствами бета-лактамного типа для лечений инфекцион- ных заболеваний, вызываемых, например, бета-лактамантибиотик — устойчивой Е.cori, равные количества
С-19393 $ и ампициллина растворяют в физиологическом растворе с целью получения инъекционного раствора, которыи может применяТься парантерально, например подкожно или внутримышечно с дозой 0,1-20 мг/кг/день, предпочтительно, 0,5-5 мг/кг/день.
С-19393 S может также применяться и орально с дозой 1-?00 мг/кг/дань, предпочтительно, 5-100 MI /кг день, а. виде капсул, каждая из которых содержит равное количество С-19393 S и цефалексина.
Если антибиотик С-19393 S ucZ пользуется в качестве дезинфицирующего средства, жидкий препарат, например водный раствор, содержащий антибиотик С-19393 S с концентраци2 ей 0,1-10 вес/об.Ъ и бензилпенициллин с концентрацией 0,1-1,0 вес/об.Ъ, или мазь, содержащая 5-20 мг
С-19393 S и 5-20 мг бензилпенициллина на 1 г белого петролатума или ланолина,. в качестве основания, могут использоваться в качестве бактерицида или дезинфецирующего средства для обработки верхних и нижних конечностей, глаз, ушей и т.п. у указанных выше животных.
Антибиотик С-19393 S .ÿâëÿåòcÿ также весьма полезным промежуточным соединением для синтеза новых типов фармацевтических препаратов.
Антибиотик устойчив в водном растворе в области нейтральных значений рН.
Физиологические свойства
С-19393 Н2 описаны ниже.
Антимикробиальный спектр натриевой соли С-19393 Н против различ2 ных микроорганизмов представлен в табл.3 и, как следствие из результатов, представленных в-табл.3, антибиотик С-19393 Н проявляет
2 антибактериальную активность против грамположительных и грамотрицательных бактерий.
1075984
Таблица 3
Минимальная ингиби рующая концентрация, мг/мл
Микроорганизм
Escherichia cori.
NXHJ
0,68
0,31
0,31
Proteus vugg garis
XFO 3045
Proteus mirabiФis
IF0 3845
0,31
0,16
0,63
Sarc1na tutea
ХЗО 323.2
0,31
Вас1И us subti fis
XFO 3513
0,31
Антибактериалыщй спектр действий натриевой соли антибиотика
С-19393 Н представлен в табл.3.
Яа/щопеХРà typhimu,rium IFO 12529
КдеЬз1еИа pneumoniae
IFO 3381
Serrat1a marcescens
IFO 12648
А1саФ1депез faeca.0is
IFO 13111
Pseudomonas aeruginosa
IFO 3080
Comamonas t.errigena
IFO 13299
Staphylococcus aureus
209Р
Вас1Ииз cereus ХГО 3460 10
Среда — бульонный агар.
Как следует из табл.З антибиотик
С-19393 Н,, полученный .в соотвЕтствии с изобретением, обладает антимикробной активностью против грамположительных и грамотрицательных бактерий и, таким образом, мо25
65 жет использоваться для лечения бактериальных инфекций у млекопитающих, например у мышей, крыс, собак, людей и пр., а также у птиц, например у куриц, уток и т.п.
Для использования С-19393 Н в
2 качестве средства для лечения например, инфекцирования Е.cori, С-19393 Н растворяют в физиологическом растворе с целью получения раствора для инъекций, который может применяться парентерально, например подкожно или внутримышечно, с дозой 0,1"50 мг/кг/день, предпочтительно, 0,5-20 мг/кг/день.
В случае орального применения анти биотик С-19393 Н смешивают с лак2 тозой и капсулируют с целью получения капсульного препарата, который может применяться-с дозой
1-100 мг/кг/день, предпочтительно
5-50 мг/кг/день.
Антибиотик С-19393 Н>, полученный согласно изобретению, может . использоваться в качестве дезинфецирующего средства, Так, например, жидкий препарат, полученный растворителем С-19393 Н в дистиллирован2 ной воде с концентрацией 0,010,1 вес/об.Ъ или мазь, содержащая
0,2-20 мг, предпочтительно, 1-10 мг
С-J.9393 Н на 1 г белого петролату2 ма или ланолина, в качестве основания, может использоваться как бактерицид или дезинфицирующий агент для верхних и нижних конечностей; глаз, ушей, и т.п. у указанных выше животных.
Антибиотик С-19393 Н может быть полезным в качестве промежуточного агента для синтеза новых типов фармацевтических препаратов. Антибиотик изобретения устойчив в водном, растворе при нейтральном значении рН.
Пример 1. Культуру штамма
Streptomyces С-19393 (1 FO 13886, ATC C 31486) выращивают в 200.мл культуральной среды, помещенной в
1 л Эрленмейровскую колбу с образованием спор. Эатем полученные споры суспендируют в стерильной воде с концентрацией 1,2"10 живых клеток/мл. Споровую суспензию разбавляют стерильной. водой до объема в
10 раз большего, чем начальный объем и 1 мл разбавленной суспензии используют для инокулирования
40 мл посевной среды в 200 мл Эрленмейровской колбе. Инокулированную посевную среду затем культивируют в ротационной трясучке при 28 С в течение 2 дней. Полученную в резуль хате культуру используют для ино1075984
10 кулирования 500 мл посевной среды, помещенной в 2 л колбу Сакагуши и инокулированную посевную среду культивируют в трясучке при 28 С в течение 2 дней. Полученную, таким образом, посевную культуру переносят в 50 л ферментатор из нержавеющей стали, содержащий 30 л посевной среды, содержащей 15 мл Актокола и культивируют при 28 С в течении
3 дней, при аэрации со скоростью
30 л/мин и при скорости перемешивания 280 об/мин. Культуральный бульон переносят в ферментатор емкостью 2 м, содержащий 1,2 м3 основной культуральной среды и про- 15 водят культивацию при 30 С в течение 5 дней при скорости аэрации
840 мл/мин и скорости перемешивания 180 об/мин. Засеянную среду„ используемую выше, дополняют 20 г .20 глюкозы, 30 г растворимого крахмала, 10 г сырой соевой муки, 10 г кукурузного экстракта, 5 г полипептона, 3 r хлористого натрия и 5 г осажденного карбоната кальция на 1 л среды, рН которой устанавливают равным 7,0 перед стеРилизацией, а основную культуральную среду используемую выше, дополняют 30 r глюкозы, 30 r растворимого крахмала, 15 г обезжиренной соевой муки, 15 r муки хлопкового семени, 0,25 г первичного кислого фосфата калия, О,б r кислого фосфата калия, 0,02 r хлористого кобальта и 0,,5 г
Актокола на 1 л среды, рН которой устанавливают равным 7,0 перед стерилизацией. Все среды, используемые выше, подвергают стерилизации при
120 С в течение 20 мин. !
Полученный, таким образом, ферментационный бульон фильтруют с использованием HyfLo-Supercede с получением 1230 л фильтрата, рН которого затем устанавливают равным 6,3 и пропускают через колонку, набитую 100 л активированного угля. Затем антибиотик С-19393 S2 и Н элюируют из колонки с помощью 300 л воды и 700 л 7Ъ-ного водного раство-, 50 ра изобутанола, соответственно.Элюат, содержащий С-19393 S, пропускают через колонку с Dowex 1 ° 2 (C(-форма, 2 л) и колонку промывают б л воды и элюируют 32 л 5Ъ-ного водного раствора хлористого натрия. Элю55 ат доводят до рН, равного 5 и пропускают через колонку с 4 л активированного угля. После промывания
12 л воды антибиотик элюируют 7 л
8Ъ-ного водного изобутанола и 12 л смеси 8Ъ-ного изобутанола — N/20 водного аммиака и полученный элюат концентрируют до объема в 150 мл при пониженном давлении. К концентрату добавляют 1350 мл метано- 65 ла и осадок, образовавшийся в результате, удаляют фильтрацией.
Фильтрат концентрируют до объема
200 мл и пропускают через колонку с фазой из 300 мл DEAE-Сефадекса;
A 25 (CO -форма). Колонку последовательно промывают 0,1 M и 0,2 М водными растворами хлористого натрия.(по 900 мл) и после этого антибиотик элюируют 1500 мл 0,4 М водного раствора хлористого натрия ° рН элюата устанавливают равным 5 и пропускают через колонку с 500 мл активированного угля. После промывания 1,5 л воды колонку элюируют
2,5 л смеси изобутанола N/20 водного аммиака (8:92) и элюат концентрируют досуха и к остатку добавляют ацетон с образованием 2,4 г светло-желтого порошка. После растворения порошка в небольшом количестве воды, полученный раствор пропускаlMт через колонку, набитую 1,2 л Ам-. берлита XAD-11 (100-200 меш),и элюируют (фракциями) водой. Фракции,имеющие антибиологическую активность, собирают и концентрируют и концентрат пропускают через колонку с 200 мл ЯАЕ-Сефадексом А 25 (СГформа). После промывания 600 мл
0,1 M водного раствора хлористого натрия, колонку элюируют 1,2 л
0,2 М водного раствора хлористого натрия. Элюат доводят до рН равного 5 и пропускают через колонку с 600 мл активированного угля.
После промывания колонки 1,8 л воды, колонку элюируют 3 л смеси
8Ъ-ного изобутанола — N/20 водного аммиака. Элюат концентрируют досуха и добавляют ацетон к остатку с получением 1,07 r порошка. 620 мг полученного, таким образом, порошка растворяют в небольшом количестве воды и полученный раствор пропускают через колонку, набитую
360 мл Амберлита XAD-11 (100200 меш). Затем колонку элюируют и фракционируют водой и каждую из . фракций, обнаруживающую антибиологическую активность, анализируют методом жидкостной хроматографии, как описано выше, дающие один пик, объединяют и концентрируют досуха и к концентрату добавляют ацетон с получением 136 мг антибиотика
С-19393 S (динатриевой соли) в ви2 де белого порошка.
Пример 2. Элюат антибиотика
С-19393 Н>, полученный в примере 1, пропускают через колонку с Доунксом
1-2 (СГ -форма, 12 л) и колонку промывают 6 л воды и элюируют 180 л
5о-ного раствора водного хлористого натрия. Полученный элюат пропускают через колонку, набитую
25 л активированного угля. После
1075984
10 промывания 75 л воды желаемый антибиотик элюируют 175 л изобутанола с водой (7:93) и элюат концентрируют до объема в 2-3 л при пониженном давлении. К концентрату добавляют 15 л метанола и полученный, 5 таким образом, осадок удаляют фильтрацией. Подученный фильтрат концентрируют до объема в 2 л и про.пускают через колонку с 5 л Диаиона
HP-20 (50 меш). Затем колонку элюируют и фракционируют 5 л воды и 10 л смеси метанол: вода (1:9).
Активные фракции Объединяют и концентрируют и концентрат пропускают через колонку с 3 л ДЕАЕ-Сефадекс
A-25 (С0 -форма). Затем колонку промывают 9 л 0,02 M водного раствора хлористого натрия и антибиотик элюируют и фракционируют 12 л
0,05 М раствора хлористого натрия.
Активные фракции пропускают через колонку, набитую 2 л Диаиона НР-20 (50 меш), который обрабатывают 4 л водного раствора хлористого натрия, активное вещество злюируют и .фракционируют 10 л смеси метанол:
5Ъ-ный водный раствор хлористого натрия (5:95) и 10 л смеси метанол:
5Ъ-ный водный раствор хлористого натрия (1:9). Активные фракции 30 пропускают через колонку с 500 мл активированного угля и, после промывания 1 5 л воды, элюируют 2,5 л
7Ъ-ного водного изобутанола. Злюат концентрируют и концентрат пропус- 35 кают через колонку с 1 л Диаион
HP-20 (50-110 меш) и элюируют и фракционируют водой. Фракции, обладающие антибиологической активностью, объединяют и концентрируют 40 и концентрат пропускают через колонку, снабженную 200 мл фазы QAE-Сефадекс A-25 (CE -форма), которую предварительно обрабатывают .400 мл 0,02 М водного раствора хлористого натрия. Затем колонку последовательно промывают
0,.02 М, 0,03 М и 0,04 М водными растворами хлористого натрия (по
1 л). Активные фракции пропускают через колонку с 200 мл активированного угля и, после промывания
0,6 л воды, элюируют 1 л 7Ъ-ного водного бутанола. Элюат концентрируют и пропанол добавляют к концентрату с целью получения 90Ъ-ного водного пропанола, который затем подвергают хроматографированию на колонке с Авицелем, который обрабатывают
90Ъ-ным водным раствором пропанолом. Затем колонку элюируют 90Ъ-ным 30 водным пропанолом. Активные фракции концентрируют и концентрат подвергают хроматографированию на колонке с 350 мл Амберлита XAD-11 (100-200 меш) и колонку элюируют 65 водой. Активные фракции концентрируют и концентрат подвергают препаративной жидкостной хроматографии высокого давления с использованием
PP-18 в качестве носителя и проводят элюированием 10Ъ-ного метанола в
0,02 М фосфатном буффере (pH 6,3).
Активные фракции пропускают через колонку с 40 мл Диаиона HP-20 (100200 меш) и фракционно элюируют водой.
Каждую фракцию, обнаруживающую ан-. тимикробиальную активность, подвергают жидкостному хроматографическому анализу, описанному выше. Фракции, дающие один пик, объединяют и сушат вымораживанием с получением
12 мг С-19393 Н в виде белого порошка.
Пример 3. 1150 л фильтрата бульонной культуры получают по методике аналогичной описанной в примере 1 и его рН устанавливают равным 50 г, пропускают через колонку с 100 л активированного угля. После промывания 300 л воды, колонку, элюируют 350.л смеси раствора изобутанола с 0,02 N гидроокисью натрия (8:92).
Полученный элюат пропускают через колонку, набитую 10 л Диаиона
SA-21A (СГ -форма) и, после промывания 30 л воды колонку элюируют
100 л 5Ъ-ного водного раствора хлористого натрия. Затем элюат пропускают через колонку с 20 л Диаиона HP-20 (50 меш), которую обрабатывают 40 л 5Ъ-ного водного раствора хлористого натрия и колонку элюируют 20 л 5Ъ-ного водного раствора NaC3. Затем антибиотик
С-19393 Б H H элюируют .с колонки 40 л Н О и 60 л смеси метанол:
5Ъ-ный водный раствор NaC0 (5:95).
Полученный элюат, содержащий антибиотик С-19393 S>, доводят до рН равного 5 и пропускают через колонку, набитую 2 л активированного угля.. После промывания 6 л воды, колонку злюируют 10 л смеси 8Ъ-ного изобутанола N/20 водного аммиака и полученный элюат концентрируют. Концентрат пропускают через колонку, набитую 200 мл QAE-Сефадекса А-25 (Ct -форма), и после промывания 1 л
0,02 М водного раствора хлористого натрия колонку злюируют 1 л 0,4 М водного раствора хлористого натрия.
После обессоливания элюита хроматографированием с использованием активированного угля, его под» вергают хроматографированию через
Амберлит XAD-11 и обрабатывают таким ж способом, как и в примере 1 с получением 100 мг динатриевой соли антибиотиком С-19393 в виде бе" лого порошка.
1075984
20
Составитель С.Малютина
Редактор Г.Волкова Техреду.Мартяшова Корректор A.Çèìîêoñîâ
Заказ 543/54 . Тираж 522 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушокая наб., д. 4/5
Филиал ППН. Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4.Пример 4. Элюат антибиотика С-19393 Н, полученный в примере 3, доводят до рН равного 5 и пропускают через колонку, набитую
2 л активированного угля ° После промывания 6 л воды, колонку элюируют 10 л смеси изобутанол N/20 водный аммиак (8:92) и элюат концентрируют. Концентрат пропускают через колонку с 200 мл фазы ЯАЕСефадекс A-25 (С2 -форма) и после промывания 1 л 0,02 М водного раствора хлористого натрия, колонку элюируют 1 л..0,04 И водного раствора хлористого натрия. После обессоливания элюата хроматографирова» нием через активированный уголь, его подвергают хроматографированию на колонке с 200 мп Диаион HP-20 (100-200 меш) и колонку элюируют и фракционируют водой. Фракции, дающие единственный пик на жидкостной хроматограмме, объединяют и концентрируют и концентрат сушат вымораживанием с образованием 48 мг С-19393
Н натриевой соли в виде белого по>О рошка..
Предложенный способ позволяет получить новый антибиотик, который найдет широкое применение.в меди35 цине.
