Способ получения @ -лактамазы

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ/ -ЛАКТАМАЗЫ путем культивирования продуцента E., содержащего плазмиду pBR 322, с фагом, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода р-лактамазы, фаг Ц ApQR вносят в культуруЕ.сое;W 3101 гее , причем используют фаг -Д. ApQR с множественностью от 1 до 20 фаговых корпускул на клетку.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ .

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

09) (И)

3(Я) C 12 N 9/38

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТБУ 1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

Fl0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3516135/28-13 (22) 29. 11.82 (46) 30.04;84. Бюп. В 16 (72) В.А.Кордюм, С.И.Черных и Т.В.Сорочинская (71) Институт молекулярной биологии и генетики АН УССР (53) 612.015.1 (088.8) (56) 1. Доклады АН СССР, 1980, В 252, N 4,,с. 995-998.

2, Авторское свидетельство СССР ,по заявке Ф 3435949/13, кл. С 12 Ц 9/38, 11.02.83 (прототип). (54) (SZ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ P ЩДЯЩ1АЗЫ путем культивирования продуцента

E со6, содержащего плазмиду pBR 322, с фагом, о т. л и ч а ю шийся тем, что, с целью повьппения выхода

$-лактамазы, фаг ф ApQR вносят в культуру Е,с001M 3101 reс А" 13 бчр причем используют фаг А. ApQR c множественностью от 1 до 20 фаговых корпускул на клетку.

1089119

Цель изобретения — повышение выхода -лактамазы.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получе,ния Р -лактамазы путем культивирования продуцента Р, со » содержащего плазмиду рВК 322, с фагом, фаг 3 ApQ R вносят в культуру

Е.соб VJ3101 тес А 13 р, причем используют фаг > ApQ R с множественностью от 1 до 20 фаговых корпускул на клетку.

Способ осуществляют следующим образом.

С помощью фага Я переключают белковый синтез с бактериальной хромосомы на геном фага и геном плаэмиды. При этом в составе генома

5S

Изобретение относится к получению белковых продуктов, например ферментов иэ микроорганизмов, и

:может быть использовано для получения биологических активных веществ, 5 а частности фермента -лантамааы, из микроорганизмов в промышленных масштабах, а также для повышения биосинтеза продуктов рекомбинатных молекул ДНК плазмид при тестированин экспрессии последних.

Известен способ получения биологически активного вещества на основе многокопийных плазмид, содержащих ген, ответственный за синтез за15 данного продукта. Фрагмент ДНК с генами рестриктазы и метилазы EcoR II встраивают в мультикопийный вектор, который обеспечивает как увеличение количества копий рекомбинатной плазмиды до 10, так и более эффективную экспрессию клонированных генов ферментов, причем плаэмидная ДНК обеспечивает повышенный синтез фермента в 3 раза по срав25 нению с исходным уровнем f1) .

Недостатками данного способа является то, что после процесса амплиф..сации антибиотики необходимо удалять иэ культуральной среды, поэтому является нетехнологичным.

Наиболее.близким к предлагаемому является способ получения 13 -лакта- . мазы, включающий выращивание культуры E.соб с 600, содержащей плаз- З5 миду pBR 322 и последующее введение в эту культуру фага Яс» 857 с мутациями в генах Я и К (2 .

Недостатком известного способа является невысокий выход фермента о: о 40 фага и в составе генома плазмиды содержится ген, отвечающий за синтез интересующего нас продукта. В частности используют фаг, содержащий в своем составе ген Ар, отвечающий на синтез фермента P -лактамазы, разрушающего антибиотики с Р -лактамным кольцом, который по предлагаемому способу должен содержаться и в геноме плазмиды.

В качестве бактериальной культуры, содержащей плазмиду pBR 322 и подвергающейся заражению фагом 3 с

Ар-агентом, используют Е. со Р» W 3101

Рес А 13 èð . Используют эту культуру из-за снижения частоты рекомбинации между гомологичными последовательностями фага Я и плазмиды рВ11. 322, имеющими место в виде

Ар-гена. Мутация в гес А-гене это условие выполняет.

Культуру K.cot» 9/3101 1ес А 13 нро с плазмидой pBR 322 выращивают до плотности 1МО клеток в

1 мп при 37 (; и доводят до постоянной скорости роста, затеи заражают фагом с Ар-геном в соотношении

10 фаговых корпускул на 1 бактериальную клетку, инкубируют 2,5-3 ч при 37 С, а затем ннкубнруют 14—

15 ч при 28 С,. Инкубирование культуры, зараженной фагом, при 28 С способствует .замедлению лизиса клеток так как оптимальной для разЭ о вития фага является 37 С. Замедление лизиса клеток способствует накоплению Р -лактамазы, для чего используют цаЬаг -мутации в фаговых генах 0 и R. Ген Q является регуляторным геном, отвечающим за включение поздних генов фага, среди которых находится и ген К, продукт которого принимает участие в лизисе . бактериальной оболочки. В результате в бактериальной культуре Е,соО» N

3 10 1 гес А 13 ир, содержащей плазмиду рВК 322, в течейие 16 ч при о

37 С синтезируется 13555 ед. активности (3 -лактамазы (за единицу активности принято наименьшее коли-. чество фермента, которое инактивиру-7 ет 10 М пенициллина (60 ед.) .за 1 ч при 37 С в фосфатном буфере рН о

6,8-7,0). В этой же бактериальной культуре, не содержащей плаэмиду

pBR 322, но подвергавшейся заражению фагом 3, ApQ+ 117. R+< 54 и инкубировавшейся 2,5-3 ч при 37 С, 0

10891

Составитель В.Кузьмичев

Редактор Н.Ковалева Техред А. Кикемезей Коррекь|ьр C.llleKMaP

Заказ 2871/23 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35 ° Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 а затем 14-15 ч при 28 С, синтезируется 227796 ед активности Р -лактамазы в 1 мл культуральной жидкости. . В бактериальной культуре Е.со0 Vl

3101 гас А 13 ),. содержащей плаз- 5 миду pBR 322 и подвергавшейся заражению фагом Ариец 177 R 54, активность. Р -лактамазы после инкубирования 2,5-3 ч при 37 С, а зао тем 14-15 ч при 28 С, достигает

2 млн. ед. в 1 мл.

Пример. Культуру E ñîá W

3101 гес А 13 5цр с плазмидой

pBR 322 выращивают на среде "Аминопептид", разведенной. 0,14 M раствором NaCf в соотношении l:1 при

37 С на качалке до плотности

1х10 клеток в 1 мл. Затем эту культуру заражают фагом, содержащим Ар-ген, à gmbee -мутации

20 в генах Q u R блокирующие лизис . бактериальной клетки, что в свою очередь обеспечивает более длительное функционирование Ар-гена. 3аражение осуществляют с множественностью 10 фаговых корпускул на

1 бактериальную клетку. Фаг получают следующим образом.

Лизогенную культуру, содержащую в составе своей хромосомы нужный З0 нам фаг, в данном случае ApQ R

19 4 выращивают при 28 С на среде "Аминопептид" на качалке до плотности клеток 1х108в 1 мп. Затем эти о .клетки прогревают 20 мин при 43 С, в результате чего инактивируется фаговый репрессор благодаря 1 -мутации в Cl-гене, и фаг начинает развиваться по литическому пути, через 50 мин после прогрева (теро моиндукции) при 43 С клетки лизируют, освобождая каждые 100-200 фаговых корпускул. Если плотность клеток была 1МО мп то они обра.10 зуют 1-2 10 фаговых корпускул в

1 мл.

Заражение E.ñî < с плазмидой, выросшей до плотности 1 10,фагом с .множественностью 10 означает, что например, к 10 мл культуры надо прилить 1 мп фаговой суспензии. После внесения фага культуру выдеро живают 2,5-3 ч при 37 С, затем . культуру, зараженную фагом, инкубируют при 28 С в.течение 14 ч.

Перенесение культуры с оптимальной температуры на пониженную способствует замедлению развития фага и более длительному функционированию Ар-гена. За это время в 1 мп суспензии накапливается до 2 мпн.ед активности f3 -лактамазы.